牛乳菌落總數測定的不確定度評定

井麗娟，王云霞，李翠枝，呂志勇，劉麗君*

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司質量管理部，內蒙古 呼和浩特 010110）

近年來食品安全問題倍受關注，菌落總數是評價食品衛生狀況的一項重要指標[1-2]，通過檢測菌落總數能夠直觀反映出食品衛生的優劣，為其衛生學評價提供數據支持。目前國內依據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[3]檢測菌落總數，雖然檢測步驟并不復雜，但檢測結果的準確性卻受到樣品均勻性、樣品制備、稀釋過程、培養條件、菌落計數、儀器精度、實驗環境等多種因素的影響，這些因素單獨或復合對檢測結果造成一定的誤差，因此需要通過分析與評定這些因素引入的不確定度，進一步減少誤差的影響。

不確定度是表征被測量的真值所處量值范圍的評定[4-5]，按照某一置信概率給出真值可能落入的區間，可使檢測數據更加客觀和科學，尤其是當所檢樣品的檢測結果接近判定限量值時，為了保證檢測結果更為客觀、精準，進行不確定度分析和評定就顯得尤為重要和必要，這對提供準確的數據及據此數據出具符合性判定具有重要意義。

實驗室認可文件CNAS-CL01-A001《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》[6]和CNAS-CL07《測量不確定度的要求》[7]都對微生物檢測結果的不確定度評定提出了明確的要求：規定微生物檢測實驗室應考慮到檢測中各種主要的不確定度分量，并有能力對每個量化的測量結果進行不確定度的評估，在某些情況下，考慮到檢測結果的重要性，需要列出主要的不確定度分量，并做出合理評估。因此通過認可審核的檢測實驗室必須嚴格執行對微生物測定結果不確定度的分析與評定。

本研究依據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[3]檢測牛乳樣品的菌落總數，按照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》規范[8]分析檢測結果不確定度的來源并建立數學模型，然后分別對引入的不確定度分量進行評定，最終以合成計算的方法評定菌落總數的不確定度，通過有效評定菌落總數測定結果的不確定度[9-12]，能夠進一步提升實驗室檢測數據的準確度和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品 市售；平板計數瓊脂（plate counting agar，PCA）、無菌生理鹽水 北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ML1602電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；0400/001/EU無菌均質器 英國Seward公司；BPX-162電熱恒溫培養箱 上海博迅科技有限公司；GI54DW高壓滅菌鍋 廈門至微儀器有限公司；88880018漩渦振蕩器美國Thermo Fisher公司；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數測定

依據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗標準 菌落總數測定》[3]方法制備樣品并檢測：無菌量取25 mL牛乳樣品至無菌均質袋內，加入225 mL無菌生理鹽水，用拍擊式均質器拍打1 min，制成1∶10的均勻樣液；根據對該樣品污染度的估計選擇2～3 個連續稀釋度，每個稀釋度分別吸取1 mL稀釋樣液接種2 塊平皿，同時以無菌生理鹽水為空白對照；每塊平皿傾注15～20 mL約46 ℃的PCA培養基，待培養基凝固后，翻轉平皿并置于（36±1） ℃培養（48±2） h，計數各平板的菌落總數并報告結果。

1.3.2 不確定度評定

依據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》規范[8]分析和評估測定過程產生的不確定度分量，最終合成評定菌落總數的不確定度。

2 結果與分析

2.1 建立數學模型

根據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗標準 菌落總數測定》[3]中菌落總數的計算公式建立以下數學模型，選取菌落數30～300 CFU的平板進行計數，測定菌落總數，如式（1）所示。

式中：Y為單次測定菌落總數/（CFU/mL）；n為樣品的稀釋倍數；N為1 mL樣品稀釋液中的菌落數/CFU；V為樣品稀釋液的體積/mL。

2.2 分析不確定度來源

雖然菌落總數測定的檢測步驟并不復雜，但影響菌落總數測定結果的因素包括很多，如樣品稱量的準確性、培養條件、均質時長、樣品均一性、倍比稀釋、菌落計數、重復測定等多個方面[13-14]。本研究主要從樣品稱量、稀釋過程、加樣體積、重復測定方面進行不確定度的分析與評定，由于本次實驗由同一實驗人員嚴格按照國標方法完成單一牛乳樣品的檢測，所以均質、培養和環境等因素對菌落總數結果不確定度的影響統一歸入重復性測定中進行分析與評定。

2.3 不確定度分量評定

2.3.1 樣品稱量引入的不確定度

樣品制備過程中使用量筒無菌量取25 mL牛乳樣品至無菌均質袋內，依據JJG 196—2006《常用玻璃量器》[15]的規定：25 mL量入式量筒的容量允差絕對值為0.25 mL，按照三角分布考慮，包含因子則25 mL牛乳樣品稱量時引入的標準不確定度和對應的相對標準不確定度按式（2）～（3）計算。

式中：u（VS）為使用25 mL量筒量取25 mL牛乳樣品過程中引入的標準不確定度；urel（VS）為對應的相對標準不確定度。

2.3.2 制樣引入的不確定度

加入225 mL無菌生理鹽水于上述稱量的25 mL牛乳樣品中，得到1∶10的稀釋樣液，根據JJG 196—2006《常用玻璃量器》[15]規定：250 mL量筒容量允差絕對值為1.0 mL，按照三角分布考慮，則使用250 mL量筒量取225 mL無菌生理鹽水制備1∶10稀釋樣液過程中引入的標準不確定度和對應的相對標準不確定度按式（4）～（5）計算。

式中：u（VF）為使用250 mL量筒量取225 mL無菌生理鹽水制備1∶10稀釋樣液過程中引入的標準不確定度；urel（VF）為對應的相對標準不確定度。

2.3.3 逐級稀釋引入的不確定度

將牛乳樣品逐級倍比稀釋為1∶10、1∶100和1∶1 000的樣液，在稀釋過程中分別使用分度吸管移取1 mL和9 mL的稀釋液，根據JJG 196—2006《常用玻璃量器》[15]的規定：1 mL分度吸管（A級）容量允差絕對值為0.008 mL，10 mL分度吸管（A級）容量允差絕對值為0.05 mL，按照三角分布考慮，，則樣品在逐級倍比稀釋過程中由1 mL分度吸管（A級）引入的標準不確定度u（VD1）和對應的相對標準不確定度urel（VD1）按式（6）～（7）計算。

由10 mL分度吸管（A級）引入的標準不確定度u（VD10）和對應的相對標準不確定度urel（VD10）按式（8）～（9）計算。

由菌落計數結果可知，該牛乳樣品在1∶1 000稀釋平板上的菌落數不符合計數范圍，而在1∶10、1∶100稀釋平板上的菌落數符合菌落總數的計數范圍，可用于計算菌落總數的檢測結果。牛乳樣品在1∶10、1∶100逐級稀釋過程中引入的相對標準不確定度urel（N）按式（10）計算。

2.3.4 加樣體積引入的不確定度

選擇適宜的稀釋度，分別吸取1 mL稀釋樣液接種2 塊平皿，吸取的加樣體積為1 mL，不確定度主要來源于分度吸管的最大允許誤差，根據JJG 196—2006《常用玻璃量器》[15]的規定：1 mL分度吸管（A級）容量允差絕對值為0.008 mL，按照三角分布考慮，，則加樣過程引入的標準不確定度和對應的相對標準不確定度按式（11）～（12）計算。

式中：u（V）為使用1 mL分度吸管加樣過程中引入的標準不確定度；urel（V）為對應的相對標準不確定度。

2.3.5 菌落總數測定的相對標準不確定度

由上述所得的逐級稀釋引入的相對標準不確定度urel（N）和加樣體積的相對標準不確定度urel（V），可以得到菌落總數測量的相對標準不確定度urel（Y），按式（13）計算。

式中：urel（Y）是從樣品稱量、制樣過程、稀釋過程、加樣體積過程分析和評定得到的菌落總數測定的相對標準不確定度。

2.3.6 樣品重復測定的標準不確定度

牛乳樣品的菌落總數測定6 次，對每個稀釋度平板上的菌落總數進行計數，然后將菌落總數測定結果取對數，計算其平均值和標準差，根據測量不確定度的A類評定方法對其進行統計學分析與評定，得到重復測量的標準不確定度。菌落總數測定結果見表1。

表 1 菌落總數計數結果Table 1 Results of APC

依據表1的數據，利用貝塞爾公式計算牛乳樣品菌落總數測定的標準偏差，按式（14）計算。

式中：S為測定樣品的標準偏差；ai為計數結果的對數值；a為計數結果對數值的平均值；n為平行樣品數量。

又因本次實驗中平行測定的次數為2 次，所以由樣品重復測量引入的標準不確定度u（R）按式（15）計算。

2.4 合成標準不確定度

綜合以上各不確定分量的計算結果，牛乳樣品菌落總數測定的合成標準不確定度uc（YR）按式（16）計算。

2.5 擴展標準不確定度

根據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[8]要求：當包含概率p=95%、K=2時，計算擴展不確定度U，按式（17）計算。

2.6 結果報告

菌落總數測定結果的對數平均值為3.9 6 7，當p=95%、K=2時，該牛乳樣品菌落總數測定結果的擴展不確定度U為0.043 4，所以結合擴展不確定度計算測定結果對數的取值區間為[3.967-0.043 4，3.967+0.043 4]，對此區間值取反對數即可得出該樣品的菌落總數為8 395～10 233 CFU/mL。

3 討 論

3.1 不確定度的類型

在日常檢測分析實驗室中不確定度的類型分為2 類：1）A類不確定度評定：用統計分析的方法對被測量進行不確定度評定，稱為不確定度A類評定，它是通過多次重復測量，然后計算平均值、標準差，進而求得的測量不確定度[16-17]，A類評定是在重復性測定的基礎上進行，充分考慮各個影響因素的作用，所以更為真實、客觀、有說服力；2）B類不確定度評定：在實際測量中，不能或無需進行多次重復測量，其不確定度只能用非統計分析的方法進行評定，稱為B類評定，它是根據實驗、相關經驗或信息來近似估計，一般需要先估計被測量的可能值區間，假設被測量值的概率分布，根據這一范圍可能的分布進而推算不確定度。

3.2 不確定度的來源

微生物測定結果不確定度的來源非常復雜，影響因素較多，著重從檢測實驗的過程和實驗環境方面進行考慮和分析[18-20]，如被測樣品、所用的儀器設備、實驗環境、操作人員和檢測方法等，逐一分析后確定主要和關鍵的不確定度來源，進而對這些主要的不確定度分量進行計算與評定。

3.3 不確定度的評定

在對測定結果進行不確定度的評定過程中，首先確定被測量和測量方法，然后建立數學模型，分析被測量與各輸入量之間的函數關系[20-24]；按照3.2節所述的各方面因素考慮和分析不確定度的來源；按照3.1節進行A類不確定度和B類不確定度的評定；通過計算各個不確定度分量進而合成標準不確定度；再根據被測量的概率分布、置信水平和包含因子計算擴展不確定度[25-26]，最終報告測定結果的不確定度，至此即完成了對測定結果不確定度的評定。

4 結 論

在菌落總數測定和數據統計的過程中首先應盡可能全面、充分考慮各類因素對測定結果產生的影響[27-28]，重點分析稱量、加樣、稀釋、計數、重復測定等因素引入的不確定度，依據數學模型計算各不確定度分量引入的不確定度。由于菌落總數檢測結果的數據發散性較大、不符合正態分布，不適用于直接計算其標準差，因此需取其對數后再進行數據的統計分析，利用貝塞爾公式計算標準不確定度，最終合成菌落總數測定的不確定度，以進一步減少各方面引入的誤差，使檢測結果更加接近真值。應用不確定度的分析與評定方法能夠有效確保檢測數據的準確性、可靠性、客觀性和科學性，為微生物實驗室的實際檢測工作提供有力支持。