甲狀旁腺素相關蛋白核定位序列及C-末端缺失對幼年小鼠下頜切牙發育影響及機制研究

劉洪 顏成東 蔣尚飛

甲狀旁腺素相關蛋白(parathyroid hormone related protein, PTHrP)已經被證實分布于人體的多種器官和組織，如牙齒、骨骼、皮膚等[1]。其N末端的氨基酸序列和甲狀旁腺素(parathyroid hormone, PTH)高度同源，并且共享PTH/PTHrP 1型受體(PTH/PTHrP type 1 receptor)，發揮類似的生理學功能；而其核定位序列和C-末端能夠進入胞核，發揮調節細胞周期功能[2]。利用基因工程手段制作僅表達PTHrP蛋白N末端1-84位氨基酸的動物模型PTHrP knock in(PTHrP KI)小鼠[3]，并且和野生型(wild type, WT)小鼠相比，結果發現PTHrP KI小鼠的下頜磨牙發育明顯不良，Hertwig上皮根鞘(herswig's epithelial root，HERs)細胞增殖減少，顯示細胞凋亡的指標如p27明顯上調[4]。活性氧(reactive oxygen species, ROS)由線粒體在進行呼吸作用時產生，是有氧代謝的副產物，包括超氧陰離子自由基(O2-·)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH·)和單線態氧等[5]。研究表明，ROS能直接損傷DNA導致細胞凋亡，而體內多余的ROS能夠被超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1，SOD1)、超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2，SOD2)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)等酶抗氧化系統所清除[6-8]。本次研究使用2 周齡PTHrP KI小鼠并與同窩的WT小鼠比較下頜切牙的發育、礦化和凋亡情況，并檢測相關酶抗氧化系統的RNA表達水平。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

將成年雌雄PTHrP KI雜合子小鼠(小鼠購自江蘇省實驗動物中心)合籠，子代小鼠出生后立即剪尾尖提取DNA，使用PCR擴增目標片段并使用BstEⅡ內切酶進行酶切PCR產物，電泳后鑒定基因型[9]，獲得同窩的野生型(wild type, WT)小鼠和PTHrP KI仔鼠，為了控制實驗的均一性，控制每窩WT小鼠和PTHrP小鼠均為2 只。小鼠生長至2 周齡使用頸椎脫臼法處死、取材，WT小鼠和PTHrP KI小鼠分別取20 只進行X線檢查、切片染色和real-time RT-PCR檢測。本次實驗經過江蘇醫藥職業學院倫理委員會審核通過。……