廣西Tanay病毒粒子形態觀察

李楠，何于雯，孟錦昕，王靜林

(云南省畜牧獸醫科學院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224)

Negevirus病毒，為單股正鏈RNA病毒，是新發現的昆蟲特異性病毒，這類病毒可分為Nelorpivirus和Sandewavirus[1,2]兩個不同的進化分支。Nelorpivirus進化分支由Negev virus(NEGV)、Loreto virus(LORV)和 Piura virus(PIUV)組成；Sandewavirus進化分支包括Santana virus(SANV)、Dezidougou virus(DEZV)、Wallerfield virus(WALV)以及相關病毒[3,4]。2014年，從菲律賓采集的蚊蟲分離到4株病毒，經鑒定為Sandewavirus進化分支的一個新種病毒，Tanay病毒[5]。2013年，從廣西采集的庫蚊標本中再次分離獲得7株Tanay-like病毒，但與菲律賓的Tanay病毒全基因組核苷酸序列存在20%左右的差異[6]，提示廣西分離的病毒可能是新的Tanay病毒。本研究通過透射電子顯微技術對Tanay病毒粒子的形態進行觀察，以期為該病毒的基礎理論研究及人或動物相關蟲媒病毒病的防控研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒株及細胞：GX13M50株病毒于2013年分離自廣西南寧市馬山縣郊區采集的致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)，經分子生物學鑒定為Tanay病毒，-80 ℃冰箱保存備用；C6/36細胞由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供。

1.2 病毒復壯及培養

將培養長至單層的25 cm2大小的C6/36細胞倒去培養液，接種200 μL解凍后的GX13M50病毒液，置于28 ℃恒溫箱培養吸附1 h，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的細胞維持液，置于28 ℃恒溫培養箱繼續培養，將培養2代的細胞培養物凍融3次后作為復壯后的種子病毒，取復壯后的GX13M50病毒液接種C6/36細胞，置于28 ℃恒溫培養并每日觀察細胞病變情況。

1.3 電鏡觀察

當細胞剛出現病變未脫落時，留約1 mL細胞培養液，用細胞刮將細胞輕輕刮下，1 000 r/min離心20 min,棄上清，沉淀用2.5%戊二醛置于4 ℃固定2 h，再用1%鋨酸固定2 h，乙醇梯度脫水后，沉淀用環氧樹脂浸漬、包埋，用超薄切片機將細胞沉淀物切成80 nm厚的超薄切片，用1%醋酸雙氧鈾和0.2%檸檬酸鉛雙重染色后用電鏡觀察病毒粒子。

2 結果

2.1 GX13M50感染C6/36細胞的病變觀察

用復壯后的GX13M50病毒液接種C6/36細胞，接種96 h后開始產生細胞病變，其特征為細胞聚集、折光性變強、脫落(圖1)。

A B

2.2 病毒粒子電鏡觀察

通過電鏡觀察可以清晰地看到，C6/36 細胞的細胞質中存在較多的子代病毒聚集，并可見成熟病毒粒子釋放出胞；成熟Tanay病毒粒子呈橢圓形，直徑大約為50 nm，并有一個短的突出物(圖2)。

A B

3 討論

Negevirus病毒大多分離自蚊蟲、白蛉等吸血昆蟲，尤其在蚊蟲中有較高的感染率。蚊蟲是很多致病病毒的載體，其中許多對人類及動物的健康都有相當大的影響，如登革熱病毒、基孔肯雅病毒和日本腦炎病毒等均可致人類嚴重疾病[7,8]。Negevirus病毒可以在蚊子細胞中復制，但不能在脊椎動物細胞中復制，通常不會引起宿主動物疾病[9]。有研究報道，許多經節肢動物傳播的感染脊椎動物和植物的病毒最初是節肢動物病毒[10]。感染的蚊蟲在吸血過程中，使病毒與脊椎動物親密接觸，從而可能增加病毒適應脊椎動物的能力并成為其病原體。此外，這些新分離的病毒地理分布和昆蟲宿主范圍廣泛，推測很有可能會感染其他類型的昆蟲；這些病毒在昆蟲宿主中傳播及其在自然界的循環還有待進一步研究。Negevirus病毒的進一步分離及鑒定，對了解這類病毒的地理分布、遺傳進化以及蚊媒疾病的控制具有重要意義。

本研究通過C6/36細胞對廣西新分離病毒GX13M50株進行復壯及培養，接種96 h后，被感染細胞出現聚集、折光性變強、脫落等明顯病變特征；進一步的超薄切片電鏡觀察結果顯示，Tanay病毒寄生在C6/36 細胞的細胞質中，利用細胞質的養分進行增殖；說明該病毒對C6/36細胞有較好的適應性。2013年Vasilakis等最早通過電鏡觀察發現Negev、Ngewotan、Piura、Loreto、Dezidougou和 Santana病毒粒子呈球形顆粒，直徑為45～55 nm[11]。本研究中對Tanay病毒形態觀察結果顯示，病毒粒子為橢圓形，直徑約50 nm，并具有一個短的突起；該病毒粒子具有明顯的形態學特點，這與Nabeshima[5]等報道的Tanay病毒負染電鏡觀察結果一致。電鏡觀察是最常用的病原鑒定方法，可快速診斷及鑒別病毒感染，本研究有助于了解Tanay病毒的形態學特征，為該病毒的形態學診斷及進一步深入研究提供基礎數據。

致謝：感謝公益性行業(農業)科研專項(201303035)在昆蟲樣品采集中給予的資助，感謝廣西獸醫研究所吳健敏教授在標本采集給予支持和幫助，感謝曹穎穎在病毒分離中給予的幫助。