急性脊髓損傷后炎癥反應、自噬和凋亡相關因子的變化以及JAK2/STAT3信號通路研究

彭 成，劉佩雷，陶 鈞，張 樂，陶奇昌，代建昊，李 強

急性脊髓損傷(Acute Spinal Cord Injury，ASCI)分為急性期(2周內)和慢性期(2周～6個月)病理改變，其中急性期臨床癥狀以機械性脊髓神經結構破壞為主[1]，如感覺、運動功能下降或喪失，部分患者急性期神經缺失癥狀可能不明顯，導致治療延誤。而持續的炎癥反應、神經細胞凋亡將進一步加重神經細胞的功能喪失，這是導致ASCI后神經功能永久性障礙的重要原因之一[2]。研究發現，ASCI急性期和慢性期均可觀察到自噬活性的增強，且與神經細胞的功能障礙有關[3]。JAK2/STAT3信號通路是真核生物體內調控多種細胞因子和生長因子表達以及細胞增殖、分化和凋亡的重要細胞內途徑之一，同樣也參與ASCI的發生發展過程[4]?；诖?，本研究觀察大鼠ASCI后神經細胞炎癥、自噬、凋亡相關因子的表達水平，揭示其JAK2/STAT3信號通路活化機制，從而為ASCI的靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設備 主要儀器：光學顯微鏡和熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，蛋白電泳儀、超聲溶解儀購自北京六一廠，PVDF膜購自美國R&D公司。主要試劑：兔抗大鼠白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、熱休克蛋白-27(Heat Shock Protein-27，HSP-27)單克隆抗體一抗及羊抗兔對應抗體二抗，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液均購自江蘇碧云天科技有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑，兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白和β-actin抗體一抗及羊抗兔對應抗體二抗均購自美國Sigma公司；兔抗大鼠微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubule-Associated Protein1 Light Chain 3，MAP1LC3)-Ⅱ抗體一抗及羊抗兔對應抗體二抗均購自北京中杉金橋生物有限公司；Lab Works 4.5凝膠成像軟件購件美國Invitrogen公司。

1.2 實驗動物 選擇健康成年8～10周齡SD雄性大鼠45只，體質量(245±25)g，購自上海生工動物實驗中心(動物許可證號：滬2018-04-012)，適應性飼養1周后進入實驗。

1.3 分組 將45只大鼠隨機分為假手術組、模型組和JAK2抑制劑AG-490干預組，每組各15只。假手術組僅切開T9全椎板，不損傷脊髓。模型組采用改良Allen法[5]復制ASCI模型(大鼠出現擺尾反射、雙下肢和軀體回縮樣撲動、清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓視為造模成功)；AG-490干預組將AG-490溶于45%甲基亞楓溶劑中，在復制ASCI模型(與模型組同法)前20 min經腹腔注入。

1.4 檢測指標 參考Delgado[5]研究分別于損傷后6、12和24 h處死大鼠(每組每個時間點各5只)，檢測脊髓組織中IL-6、TNF-α、HSP-27分子和MAP1LC3-Ⅱ的陽性表達率，以及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白和Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表達水平。

1.4.1 免疫組化染色 大鼠麻醉、打開胸腔、切開右心耳、4%多聚甲醛固定40 min，經背部切口鈍性剝離脊髓，獲取以損傷段為中心、長約1 cm的脊髓組織。常規制作脊髓組織切片，厚度5 μm，處理后滴加兔抗大鼠IL-6、TNF-α和HSP-27單克隆抗體一抗(工作濃度1∶2 000)，置于濕盒內4 ℃孵育過夜，以正常大鼠IgG代替一抗作為陰性對照；PBS溶液洗滌后滴加羊抗兔對應抗體二抗(工作濃度1∶500)，置于濕盒中27 ℃孵育20 min；PBS溶液洗滌后滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液置于濕盒中27 ℃孵育20 min；PBS溶液洗滌、DAB顯色后封片觀察。結果判定：每張切片選擇上、下、左、右和中央5個視野，以細胞核或胞漿黃染為陽性細胞，計算陽性細胞占視野中所有細胞的百分比，結果取平均值。

1.4.2 Western Blot法檢測 將獲取的脊髓組織剪成小片狀多次離心，超聲碎解后加入BCA蛋白定量檢測試劑，經內參β-actin抗體進行劑量標準化。取30 μg樣品蛋白和等量標準蛋白，于8%SDS-PAGE電泳分離，將分離區帶電轉移至PVDF膜；滴加兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白和β-actin抗體一抗(工作濃度1∶2 000)靜置過夜；PBS溶液洗滌后滴加羊抗兔對應抗體二抗(工作濃度1∶500)室溫孵育4 h；PBS溶液洗滌、ECL顯色，結果掃描保存，采用Lab Works4.5凝膠成像軟件進行半定量分析，以目標蛋白與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值為最終結果。

1.4.3 免疫熒光標記法檢測 脊髓組織切片經前期處理(同1.4.1)后，滴加兔抗大鼠MAP1LC3-Ⅱ抗體一抗(工作濃度1∶500)4 ℃孵育過夜；PBS溶液洗滌后滴加熒光標記羊抗兔抗體二抗(工作濃度1∶500)4 ℃孵育過夜；PBS溶液洗滌后DAPI染色2 min，避光條件下采用熒光顯微鏡觀察。于400倍視野下選擇上、下，左、右和中央共5個區域，計算MAP1LC3-Ⅱ陽性細胞數百分比。

2 結果

2.1 三組各時間點脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27分子陽性表達率 與假手術組比較，模型組各時間點脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27陽性表達率增加(P<0.05)，而干預組各時間點上述指標低于模型組(P<0.05，圖1，圖2)。

圖1 脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27分子陽性表達(免疫組化染色×100)

圖2 三組各時間點脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27分子陽性表達率比較模型組同時間點與假手術組比較，#P<0.05；干預組同時間點與模型組比較，*P<0.05

2.2 三組各時間點脊髓組織JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平 與假手術組比較，模型組各時間點脊髓組織p-JAK、p-STAT3蛋白表達水平增加，而干預組各時間點上述指標均低于模型組(P<0.05)；三組各時間點脊髓組織JAK2、STAT3總蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖3、圖4)。

圖3 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin蛋白表達

圖4 三組各時間點脊髓組織JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平的比較模型組同時間點與假手術組比較，#P<0.05；干預組同時間點與模型組比較，*P<0.05

2.3 三組各時間點脊髓組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達率 與假手術組比較，模型組各時間點組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達率增加，而干預組各時間點均低于模型組(P<0.05，圖5，圖6)。

圖5 脊髓組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達(×400)

圖6 三組各時間點脊髓組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達率比較模型組同時間點與假手術組比較，#P<0.05；干預組同時間點與模型組比較，*P<0.05

2.4 三組各時間點脊髓組織Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達水平 與假手術組比較，模型組各時間點組織Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達水平均增加，而干預組各時間點上述指標均低于模型組(P<0.05，圖7)。

圖7 三組各時間點脊髓組織Caspase-3和bax/bcl-2蛋白表達水平比較模型組同時間點與假手術組比較，#P<0.05；干預組同時間點與模型組比較，*P<0.05

3 討論

繼發神經細胞功能障礙是ASCI的主要病理機制，也是改善患者生存預后的重要靶點。根據既往報道，炎癥反應、細胞凋亡和自噬行為在ASCI繼發神經細胞功能障礙的發生和發展過程中扮演重要角色。揭示ASCI后實驗動物脊髓組織的炎癥反應、細胞凋亡和自噬相關因子的水平，同時觀察靶向干預JAK2/STAT3信號通路對上述病理過程的影響，對于理解疾病發生機制以及提供針對性干預位點具有重要意義。

3.1 ASCI后神經細胞炎癥反應相關因子變化 早期炎癥反應的敏感標志物有IL-6、TNF-α和HSP-27等[6]。HSP-27是細胞在缺氧、應激環境下大量表達的一種損傷修復分子，主要發揮“分子伴侶”的功能，在不同細胞局部環境誘導下，發揮不同的生物學效應。也就是說，HSP-27既可降低損傷細胞DNA折疊錯誤率、增強細胞抵御損傷因素的能力，又可激活細胞周期分裂，促使細胞DNA錯配和異常蛋白的翻譯和表達[7]。Boraiah等[8]研究指出，與第0天比較，第30天HSP-27表達顯著下調，HSP-27可能在脊髓損傷中發揮重要作用。Nasouti等[9]研究指出，海藻糖可以通過調節HSP-27和HSP-70及Caspase-3基因的表達來保護脊髓免受損傷。

本研究結果發現，模型組6、12、24 h脊髓組織IL-6、TNF-α和HSP-27陽性表達率均高于假手術組，而干預組則低于模型組(P<0.05)，提示炎癥反應紊亂參與了ASCI的發生過程，干預JAK2/STAT3信號通路能夠抑制炎癥反應，阻止ASCI進程。

需要強調的是，JAK2/STAT3信號通路的活化既需要炎癥因子IL-6和TNF-α的誘導，同時又可加劇炎癥因子的釋放，形成炎癥瀑布樣級聯反應傷[10]。因此，本研究觀察到，除了假手術組，模型組和干預組IL-6、TNF-α和HSP-27陽性表達率隨損傷時間的延長而不斷升高，24 h內未觀察到峰值出現，提示炎癥反應可伴隨ASCI發生的早期全過程，且隨時間延長而程度加重[11]。

3.2 ASCI后神經細胞凋亡和自噬相關因子變化 凋亡機制在ASCI中也起到重要作用。凋亡下游多種途徑的共同效應因子Caspase-3是蛋白酶級聯反應的組成部分，主要通過對蛋白激酶、核酸酶及細胞骨架的裂解，產生核皺縮、DNA片段等凋亡現象，最終控制凋亡的發生和進程[12]，其表達水平可反映細胞凋亡的程度。Bax/Bcl-2比值則往往決定凋亡的方向，當抗凋亡分子Bcl-2/促凋亡分子Bax>50%時，細胞表現明顯的抗凋亡效應[13]。Yuan等[14]研究指出，神經節苷脂能夠抑制急性脊髓損傷大鼠Caspase-3的表達水平，進而提高神經生長因子濃度和改善脊髓損傷癥狀。Wang等[15]研究指出，丙種球蛋白缺乏通過促進小鼠神經炎癥(TNF-α/IL-1β/IL-6/IL-10)和細胞凋亡(Bax/Bcl-2)加重脊髓損傷。反映自噬活性的標志性蛋白有MAP1LC3、Atgl2與Atg5復合體等，其中AP1LC3-Ⅰ和AP1LC3-Ⅱ參與自噬體的形成，AP1LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合形成AP1LC3-Ⅱ，定位于自噬體膜上，其含量與自噬體數目成正比[16]。Wang等[17]研究還發現，大鼠脊髓損傷48 h自噬體膜上標志性的MAP1LC3-Ⅱ表達量明顯升高。本研究結果證實，模型組6、12和24 h脊髓組織MAP1LC3-Ⅱ陽性表達率、Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達水平高于假手術組，而干預組則低于模型組(P<0.05)。提示細胞自噬和凋亡參與了ASCI的發生過程，靶向干預JAK2/STAT3信號通路可抑制細胞自噬和凋亡水平。

3.3 JAK2/STAT3信號通路干預機制 JAK2/STAT3信號通路已被證實在炎癥反應、免疫調控、腫瘤發生中發揮十分重要的作用。陳霄雷等[18]研究指出，大鼠ASCI后應用AG490干預可阻斷JAK2/STAT3信號轉導通路,從而抑制細胞凋亡,促進大鼠雙下肢運動能力的恢復。在生理狀態下，JAK2/STAT3處于非磷酸化，機體受應激刺激時可發生瞬時、快速的磷酸化轉化，持續時間較短，約6～12 h，然后快速消失。而通過胞內段的酪氨酸蛋白激酶結合位點，與相應受體如IL-6、TNF-α、HSP-27等相結合，JAK2/STAT3可激活下游各種靶蛋白的酪氨酸殘基，進而發揮相應的生物學效應[19]。JAK2/STAT3信號通路在ASCI發生和發展過程中發揮重要作用，可影響炎癥反應、細胞自噬和凋亡的進程，進而影響神經功能的損傷和恢復情況。在神經損傷領域，STAT3也是一種具有關鍵作用的雙功能蛋白，靶向阻斷JAK2/STAT3信號通路激活可明顯減輕大鼠中樞和外周神經組織創傷性或缺血損害，抑制神經細胞凋亡，改善神經功能缺損。Xia等[20]研究指出，模型組p-JAK2、p-STAT3、IL-6、TNF-α和LC3-Ⅱ的表達水平以及Caspase-3和Bax/Bcl-2的mRNA表達水平均顯著高于AG-490干預組，假手術組最低(P<0.05)。認為JAK2/STAT3信號通路可介導大鼠ASCI發病后早期的自噬和凋亡活動。吳楠等[21]研究指出，脊髓損傷后miR-136-5p沉默可抑制STAT3的表達，進而抑制炎癥因子的過度表達，最終抑制脊髓炎癥反應。本研究中模型組6、12和24 h脊髓組織p-JAK2和p-STAT3蛋白表達水平高于假手術組，而干預組則低于模型組(P<0.05)。提示JAK2/STAT3通過激活后參與了ASCI的發生過程，而靶向干預JAK2/STAT3信號通路的激活程度能夠影響ASCI進程。而各組間脊髓組織中JAK2和STAT3總蛋白表達水平變化不明顯，提示只有處于激活狀態的JAK2/STAT3才能發揮相應的生物學功能，影響ASCI過程。

綜上所述，ASCI早期病理改變可能涉及神經細胞的炎癥反應、自噬、凋亡以及JAK2/STAT3信號通路的活化，靶向干預JAK2/STAT3信號通路的活化可抑制ASCI進程，進而為ASCI的靶向治療提供實驗依據。