基于生物信息學分析ADD3在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義

石 林，劉薇婉，張帥帥，任翠愛

彌漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma，DLBCL)是最常見的淋巴瘤類型，約占成人非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，在發展中國家所占比例更高。DLBCL在表觀遺傳學、治療反應、預后等方面存在較大的異質性。一線R-CHOP治療方案使60%患者能夠長期生存，但仍有40%的患者存在治療無效或短暫緩解后復發的現象[1]。因此，積極尋找新的可以提示DLBCL患者預后的獨立生物標志物，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數據庫篩選目標基因 Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)搜索設置是①分析類型：Cancer vs Normal Analysis；②癌癥類型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③數據類型：mRNA。設定條件：under-expression，選擇Diffuse Large B-Cell Lymphoma點擊compare進行分析。P<0.05有統計學意義。

1.2 分析ADD3在不同腫瘤的表達情況 搜索設置是①基因輸入：ADD3；②THRESHOLD(PVALUE):1E-4；THRESHOLD(FOLD CHANGE)：2；THRESHOLD(GENE RANK)：TOP 10%；③數據類型：mRNA。P<0.05有統計學意義。

1.3 分析ADD3在DLBCL樣本中的表達 搜索設置是①基因：ADD3；②癌癥類型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③數據類型：mRNA/DNA。P<0.05有統計學意義。

1.4 GEO數據庫下載數據集組進行生存分析 Oncomine數據庫搜索設置是①分析類型：Cancer vs Normal Analysis；②癌癥類型：Diffuse Large B-Cell Lymphoma；③臨床數據：Survival Status；選擇合適的數據集，在PUBMED上下載數據集組，進行生存分析。

1.5 基于GEPIA2在線分析網站驗證ADD3基因與DLBCL異質性生物特征分子的相關性 登錄GEPIA2網站(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)，選擇癌癥類型DLBCL，對ADD3進行“Correlation Analysis”驗證。

1.6 基于TCGA數據庫分析驗證ADD3在DLBCL不同亞組中表達情況 登陸癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)分析網站(UALCAN)(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，①Gene Symbol：ADD3；②TCGA dataset：Lymphoid Neoplasm Diffuse Large B-cell Lymphoma。點擊“explore”；③Links for analysis：Expression，對不同亞組進行分析。

2 結果

2.1 分析篩選出目的基因ADD3 篩選結果顯示Oncomine數據庫共計收錄了40個有關DLBCL的數據合集，總計樣本數據2 194個。其中符合DLBCL中“Cancer vs Normal Analysis”設置的數據集共7個，總計551個樣本數據。篩選得到排名前200的低表達基因，除去已經被研究報道過的基因，得到目的基因ADD3，ADD3在薈萃分析中，位于顯著低表達基因的104位，中位秩次492.0，P=0.02。

2.2ADD3在不同腫瘤中的差異表達情況 檢索ADD3在不同腫瘤中的差異性表達，結果顯示，Oncomine數據庫共收錄了有關ADD3的研究共692項，樣本數量總計82 519個。其中符合條件的數據集共455項，有5項研究顯示ADD3在腫瘤樣本中顯著高表達，26項研究顯示ADD3在腫瘤組織中顯著低表達，其中有11項研究顯示ADD3在淋巴瘤中低表達。這11項研究具體包括DLBCL，霍奇金淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。

2.3ADD3在DLBCL樣本中的表達情況 篩選出8個符合篩選條件的數據集，結果顯示其中7個數據集ADD3的mRNA表達量與正常樣本相比，均顯示出明顯的低表達，且所有差異均有統計學意義。ADD3的DNA表達量沒有明顯改變，提示ADD3 mRNA表達降低，可能是轉錄水平出現異常，而不是DNA拷貝數減少的影響。其中Basso Lymphoma(Under-expression Gene Rank：24，P-value：9.24E-11，t-Test：-7.839，Fold change：-2.975)，Alizadeh Lymphoma(Under-expression Gene Rank：27，P-value：1.01E-4，t-Test：-5.049，Fold change：-2.716)，Brune Lymphoma(Under-expression Gene，Rank：2 375，P-value：0.004，t-Test：-3.077，Fold change：-1.944)，Rosenwald Lymphoma(Under-expression Gene Rank：331，P-value：0.005，t-Test：-3.500，Fold change：-1.491)，Compagno Lymphoma(Under-expression Gene Rank：537，P-value：2.15E-14，t-Test：-9.739，Fold change：-2.220)，Rosenwald Multi-Cancer(Under-expression Gene Rank：492，P-value：0.002，t-Test：-3.259，Fold change：-2.276)，Storz Lymphoma(Under-expression Gene Rank：1 513，P-value：0.011，t-Test：-2.869，Fold change：-3.009)為分析mRNA表達的數據集，TCGA Lymphoma(Under-expression Gene Rank：3 809，P-value：0.140，t-Test：-1.117，Fold change：-1.025)為分析DNA表達的數據集。

2.4ADD3對DLBCL患者的預后意義 Hummel Lymphoma Dataset(GSE4475數據集)使用Human Genome U133A Array基因表達譜芯片，共檢測221例淋巴瘤患者，包括28例非典型伯基特淋巴瘤患者，8例伯基特淋巴瘤患者，1例伯基特白血病患者，18例成熟B細胞非霍奇金淋巴瘤患者和166例DLBCL患者，該數據集同時包含了患者的治療經歷，基因異位情況，總體生存時間等，其中具有完整生存信息的123例。Lenz Lymphoma Dataset(GSE10846數據集)使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，共檢測414例初治的DLBCL患者，該數據集還包含了患者的化療方案，總體生存時間，年齡，性別，疾病分期等數據。Shaknovich Lymphoma Dataset(GES23501數據集)同樣使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，共檢測69例DLBCL患者的基因表達狀況，同時記錄患者的年齡，性別，疾病分期，總體生存狀況等。從GEO數據庫下載上述3個數據集原始數據，分析DLBCL患者的生存預后與ADD3表達量之間的關系。兩個數據集生存分析結果皆顯示，ADD3低表達組預后更差，差異有統計學意義，圖1(A)、(B)。Hummel Lymphoma Dataset中共收集了166例DLBCL患者數據，去除缺少生存預后數據的樣本，符合條件的樣本共有123個，ADD3低表達組的中位生存期為12.8個月，高表達組為55.3個月，HR=0.531 3(0.323 1～0.873 6)，P=0.012 7，差異有統計學意義。Lenz Lymphoma Dataset(n=414)，ADD3低表達組中位生存期為4.13年，高表達組未達，HR=0.5642(0.415 0～0.767 0)，P=0.000 3，差異有統計學意義。圖1(C)為Shaknovich Lymphoma Dataset(n=69)數據集的分析結果，P=0.141 1，差異無統計學意義，可能與樣本數量較少有關。由于ShaknovichLymphoma Dataset與Lenz Lymphoma Dataset數據集均使用Affymetrix U133 Plus 2.0 microarrays基因芯片，整合兩個數據集進行生存分析，結果顯示，ADD3低表達組中位生存期為6.08年，高表達組未達，HR=0.579 3(0.431 1～0.778 5)，P=0.000 4，差異有統計學意義，圖1(D)。由于Lenz Lymphoma的患者分別使用了CHOP化療方案(n=181)和Rituximad-CHOP化療方案(n=233)，為了區分不同治療方案所導致的生存差異，因此，將Lenz Lymphoma分為CHOP-treated和Rituximad-CHOP-treated兩個亞組，分別進行生存分析和表達量分析，結果顯示，在不同亞組間，ADD3的表達量無明顯差異，且ADD3低表達組預后皆為不良，圖1(E)、(F)、(G)。

圖1 ADD3表達水平與患者預后關系

2.5ADD3低表達為DLBCL的預后不良因素，與年齡、性別等因素無關 對Hummel Lymphoma Dataset，Lenz Lymphoma Dataset進行亞組分析(由于Shaknovich Lymphoma Dataset樣本量較少，故不再進行亞組分析)，圖2(A)、(B)，Hummel Lymphoma Dataset數據集顯示，DLBCL中ADD3的表達量在性別和年齡亞組無顯著差異。圖2(C)顯示，Lenz Lymphoma Dataset中，在性別亞組，ADD3的表達量無明顯差異。圖2(D)顯示，Lenz Lymphoma Dataset中，在年齡亞組，21～40歲年齡組，ADD3的表達量要高于41～60歲(P=0.006)、61～80歲(P=0.013)、81～100歲(P=0.002)年齡組。由于81～100歲年齡組人數較少，且41～60歲、61～80歲、81～100歲年齡組中ADD3的表達量無明顯差異，因此，將樣本分為21～40歲年齡組和41～100歲年齡組兩個亞組進行分析，結果顯示在21～40歲亞組中，ADD3低表達組預后更差，HR=0.101 8(0.022 83～0.454 2)，P=0.002 7，差異有統計學意義，圖2(E)。41～100歲年齡組中，ADD3低表達組中位OS為3.93年，ADD3高表達組的中位OS為7.49年，HR=0.618 5(0.451 4～0.847 4)，P=0.003 1，差異有統計學意義，圖2(F)。在不同年齡亞組中，ADD3低表達組預后皆為不良。

圖2 DLBCL的預后不良因素

2.6ADD3與DLBCL異質性生物特征分子呈弱相關性 比較顯示ADD3與DLBCL異質性生物特征分子c-Myc(P=0.014，R=0.36)，Bcl2(P=0.000 55，R=0.49)，P53(P=0.003 1，R=0.42)等呈弱相關性。

2.7 UALCAN網站驗證ADD3在DLBCL不同亞組的表達 數據庫分析網站(UALCAN)，對DLBCL中疾病階段，種族，性別，體質量，年齡以及TP53突變等亞組進行逐個分析，結果顯示DLBCL中ADD3的表達與疾病階段，種族，性別，體質量，年齡以及TP53突變等無關，圖3。

圖3 ADD3在DLBCL不同亞組的表達

3 討論

DLBCL是具有高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤，根據Globalcancerstatistics 2018的最新統計[2]，非霍奇金淋巴瘤的發病率占全球癌癥發病率的2.8%，死亡率占全球癌癥致死率的2.6%，雖然一線R-CHOP化療方案使得DLBCL患者的生存率大大提高，但由于臨床與病理診斷的異質性與復雜性，仍有部分DLBCL患者，存在難治與緩解后復發等現象[3]，目前Bcl2，c-Myc，P53突變等遺傳學異常已被證實與DLBCL的預后相關[4-5]，因此，尋找新的預后生物標志物，對于治療DLBCL具有重要的臨床意義。

Ocomine數據庫是目前全球最大的癌癥基因芯片數據庫，該數據庫收納整合了全球權威研究團隊發表在專業雜志上的公開數據，主要包括腫瘤相關RNA和DNA等數據，是用于挖掘癌癥基因信息的權威數據平臺。癌癥基因圖譜(TCGA)是由美國癌癥基因研究所和美國人類基因組研究所合作啟動的項目計劃，收錄了人類不同癌癥的臨床數據，基因組變異數據，mRNA表達數據，miRNA表達數據，甲基化數據等，是癌癥研究的重要數據來源。目前基于數據庫分析，已成功挖掘出肺腺癌的靶基因KRAS[6]，多發性骨髓瘤的生物靶點CD200[7]，胰腺癌的生物靶點MALAT1[8]等，且均已得到驗證。

ADD3(Adducin 3)屬于Adducins家族，又名adducin γ，位于染色體10q24.2～24.3，是膜蛋白與肌動蛋白連接處的骨架蛋白，參與血紅蛋白中血影蛋白-肌動蛋白網絡的構建，細胞信號傳導，離子轉運，細胞運動與細胞增殖等生命活動[9]。目前關于ADD3的研究較少，Karrie[10]研究發現下調的ADD3在多形膠質母細胞瘤中具有致癌作用，并且ADD3喪失功能的多形膠質母細胞瘤細胞能夠通過VEGF/VEGFR2信號傳導刺激內皮細胞激活，促進體內腫瘤生長和血管生成。在相關研究中發現，ADD3的耗竭，加速了非小細胞肺癌細胞的遷移[11]。在膽道閉鎖的研究中顯示，ADD3基因沉默的小鼠與野生型小鼠相比，臟器纖維化程度更高，并通過與NK細胞作用，導致膽道閉鎖的發生[12]。Fan的研究顯示[13]，通過敲降ADD3的表達，會損害腎傳入小動脈和大腦中動脈的肌源性反應，并影響BK通道活性。高度的侵襲性是DLBCL的主要生物學特征，常常侵犯淋巴結組織及周圍器官，使其復發率高，預后效果差，ADD3的耗竭可能是通過減少細胞-細胞之間或細胞-基質之間的接觸，解除細胞抑制，促進DLBCL細胞遷移，同時激活血管生長，促進了DLBCL的浸潤轉移。

綜上所述，ADD3在DLBCL中低表達，且與預后呈現顯著正相關性，ADD3的功能喪失可能會解除細胞之間的接觸抑制，促進腫瘤的發生，有望作為DLBCL的獨立預后標志物，為治療和預防DLBCL提供參考靶點。