基于7-異戊二烯色氨酸合成酶催化合成C-7異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿

劉 瑞，張弘弛，李 慧，周 鳳

(山西大同大學 生命科學學院，山西大同 037009；山西大同大學 應用生物技術研究所，山西大同 037009)

異戊烯化的吲哚天然產物是存在于多種生物體(包括植物、真菌和海洋生物)中的一大類天然產物，真菌是這類天然產物的最大生產者[1-2]。目前的研究已經證實，異戊二烯基團可以通過與膜相關蛋白質的相互作用，改善生物膜的親和力[2]，進而提高異戊烯化的吲哚天然產物的生物活性。其中，這類天然產物中由異戊二烯基二磷酸的異戊二烯部分和色氨酸的吲哚環組成的異戊烯基吲哚二酮哌嗪生物堿[3]，其生物活性最特別，發現具有多種生物學和藥理活性，如抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗炎、抗腫瘤、化學預防、雌激素和抗雌激素活性等[4-5]。

在真菌細胞內，異戊烯基吲哚二酮哌嗪生物堿是經異戊二烯色氨酸合成酶催化而代謝合成。異戊二烯色氨酸合成酶(Dimethylallyl tryptophan synthase，DMATS)僅接受必需的二甲基烯丙基二磷酸酯(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)作為異戊烯基團的供體，對芳香族底物表現出廣泛的底物特異性，例如簡單的色氨酸衍生物或含色氨酸的環狀二肽，進而選擇性催化吲哚環不同位置的區域異戊烯化，可以產生具有不同生物學活性且結構多樣化的異戊烯基化吲哚二酮哌嗪生物堿，例如，FtmPT1催化了所有測試的含色氨酸的環狀二肽的C2-異戊烯化作用[6]，而AnaPT則將這些化合物在吲哚環的C3位置異戊烯化作用[7]。

因此，本研究以多種含色氨酸的環二肽為酶反應底物，催化合成C-7異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿，考察7-異戊二烯色氨酸合成酶(7-dimethylallyl tryptophan synthase，7-DMATS)對不同底物的轉化率影響，并通過分析環二肽底物與7-DMATS的分子對接關系，進一步分析C-7異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿的酶催化底物特異性機理。測定合成的C-7異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿的細胞毒性，驗證異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿可以大大提高其生物活性，并對活性最高的化合物(7b)進行7-DMATS催化反應條件的優化研究，為進一步深入研究異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿的生物合成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試劑及生化材料：各種氨基酸(國藥集團)，Ni-NTA瓊脂糖樹脂(德國Qiagen公司)，HPLC用色譜純試劑(上海星可生化有限公司)；大腸桿菌XL1-Blue MRF’，pGEM-T和pQE60 (德國Qiagen公司)；煙曲霉AspergillusfumigatusB5233(ATCC 13073)的UniZAP XR預制文庫(美國Stratagene公司)。

儀器：ESI-MS質譜儀JEOL SX102A(日本電子株式會社)，核磁共振儀Bruker ADVANCE 500 MHz(德國布魯克公司)，高效液相色譜Agilent 1200型(美國惠普公司)，自動旋光儀WZZ-3型(上海儀電物理光學儀器有限公司)。

癌細胞株：人源性宮頸癌細胞(Human cervical carcinoma cells，HeLa)由第四軍醫大學提供；人源性肺癌細胞(Human lung cancer cells，A549)和人源性乳腺癌細胞(Human breast cancer cells，MCF-7)購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 方 法

1.2.1 DMAPP和吲哚二酮哌嗪的合成 按照文獻[8]的方法，合成供體DMAPP，經HPLC測定，產物純度為96%；按照文獻[9-10]的方法合成二酮哌嗪底物(環二肽)，經HPLC測定，環二肽純度為81%～92%。

1.2.2 DNA的分離、PCR擴增和載體克隆 依據文獻[11]的方法，AspergillusfumigatusB5233的UniZAP XR預制文庫導入受體細胞后，進行7-DMATS的DNA分離，PCR擴增，片段長度為1 425 bp，包含Afu3g12930的整個編碼序列，引物為7-dmats-1(5′-CACCATGGCCATCGGAGCCGAGAT-3′)，和7-dmats-2(5′-TGCAGATCTGCTGTACACCCGGAG-3′)。其中粗體字母表示插入的突變，帶下劃線字母表示限制性位點，NcoI位于7-dmats-1的起始密碼子，BglII位于7-dmats-2的預期終止密碼子。然后將PCR片段克隆到pGEM-T中，得到質粒pLW39，其序列通過遺傳分析儀經過測序得到驗證。創建表達載體pLW40，用限制酶NcoI和BglII消化pLW39之后，將得到的1 418 bp的NcoI-BglII片段直接連接到pQE60中，pQE60提前已用NcoI和BglII消化過。獲得含有7-DMATS基因的質粒pLW40，用于蛋白質表達和純化。

1.2.3 蛋白質的表達、純化和鑒定 將pLW40轉化至大腸桿菌XL1 Blue MRF’中，重組子形成后，接種于含液態Luria-Bertani(LB)培養基的錐形瓶中，補充羧芐青霉素(終濃度50 μg·mL-1)，37 ℃下生長至OD600達0.6。加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.8 mmol·L-1，37 ℃將細胞再培養16 h。離心收集菌體，沉淀以2～5 g·mL-1(g濕重)的濃度重懸浮于裂解緩沖液(10 mmol·L-1咪唑，50 mmol·L-1NaH2PO4和300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)中，加溶菌酶(終濃度1 mg·mL-1)，冰上孵育30 min，以200 W的頻率超聲處理6次，每次10 s，裂解液在4 ℃以14 000 g離心30 min。用Ni-NTA瓊脂糖樹脂(Qiagen)進行親和層析，純化重組融合蛋白，用洗脫液(50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl，250 mmol·L-1咪唑，pH 8.0)洗脫收集，經NAP-5柱(50 mmol·L-1Tris-HCl，15%甘油，pH 7.5，平衡)交換緩沖液，SDS-PAGE 鑒定收集得目的蛋白。

1.2.4 酶催化合成反應、產物分析、分離和結構鑒定 酶催化合成反應總體積10 mL，包含50 mol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1DMAPP，1 mmol·L-1底物和50 μg(0.9 mmol·L-1)7-DMATS，pH 7.5，溫度 37 ℃，反應16 h，加10 μL三氯乙酸(1.5 mmol·L-1)終止反應，離心(15 000 g，10 min，4 ℃)除去蛋白質。通過HPLC(Agilent 1200，RP18-column，10 mm×250 mm，5 μm，1.0 mL·min-1)分析酶促產物，含0.1%三氟乙酸(溶劑A)和甲醇(溶劑B)作為溶劑，從50%到100%的溶劑B進行梯度洗脫10 min，100%溶劑B洗滌10 min后，50%溶劑B平衡色譜柱10 min，紫外檢測器設置波長277 nm。分離酶產物，使用酶產物分析相同的HPLC條件，流速為2.5 mL·min-1，檢測到的產物的峰面積與產物和底物的總和之比來計算酶反應的轉化率。收集后真空除去溶劑，凍干除水，得產物。核磁共振法(1H-NMR，500 MHz)鑒定其結構，電噴霧離子化質譜(ESI-MS)鑒定其分子量。

1.2.5 分子對接 使用結構相似的蛋白FgaPT2(PDB ID：3I4X)作為同源模板，建立 7-DMATS的同源性模型。為了考慮底物結合袋中的氫鍵網絡，在模型構建過程中還包括了底物分子。采用Ledock軟件完成對接，對接成功后，按照對接能量排序，選取最優構象，采用Pymol 1.5分析對接結果，并繪制分子對接圖。

1.2.6 細胞毒性測定 MTT法[12]測定異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿對3種癌細胞生長的抑制作用。將待測物溶于5%的DMSO，配成濃度為2 mg·mL-1的母液，用培養基將其稀釋成6個不同的濃度。將4.0×103mL-1的細胞懸液接種于96孔細胞培養板，每孔150 μL，設3個平行。24 h后，棄掉原培養液，將不同濃度含待測物的培養液加入培養板內，每孔150 μL，同時設空白對照。48 h后，棄掉原來的培養基，并向每孔加入20 μL MTT溶液和150 μL新鮮培養基，培養4 h檢測。波長490 nm下測定吸光值(A)，計算抑制率，公式如下，運用SPSS 19計算半數抑制濃度(IC50)。

IC50=[(Acontrol-Atest)/Acontrol]× 100% 其中：Acontrol為對照組的吸光度，Atest為樣品組的吸光度。

1.2.7 酶催化條件優化 為了研究活性最高的產物cyclo-L-7-dimethylallyl-Trp-L-Pro(7b)的7-DMATS的酶催化合成最佳反應條件，分別考察反應時間、pH、溫度、二價離子。優化反應時間為8～24 h；優化pH，設置各種反應緩沖液中進行酶促反應，反應緩沖液pH為4.0～6.0(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)、6.0～8.0(Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液)、7.0～9.0(Tris-HCl緩沖液)和10.0～11.0(Na2CO3-NaHCO3緩沖液)；優化反應溫度，在不同溫度(5～50 ℃)下進行酶促反應；測試二價離子對酶活性的影響，分別添加最終濃度為5 mmol·L-1的不同陽離子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+。所有酶促反應均以DMAPP為供體，cyclo-L-Trp-L-Pro(7a)為底物進行，試驗重復3次，并對酶混合物進行HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 7-DMATS蛋白的表達和純化

37 ℃下，0.8 mmol·L-1IPTG誘導攜帶pLW40的大腸桿菌細胞。通過SDS-PAGE判斷，用Ni-NTA瓊脂糖將His6-7-DMATS純化至表觀均勻性(圖1)，每升培養物獲得5 mg純化的His6-tagged 7-DMATS的蛋白。觀察到的分子質量為50 ku，這與His6-7-DMATS的54 ku的計算值非常吻合。

2.2 C-7異戊烯取代的吲哚二酮哌嗪的結構 鑒定

經7-DMATS酶催化，合成了7個C-7異戊烯取代的吲哚二酮哌嗪，以合成產率為指標，經HPLC分析(圖2)發現7-DMATS酶對底物有一定的選擇性，以cyclo-L-Trp-L-Leu(3a)為底物，轉化率最高(30.2%)，其次是以cyclo-L-Trp-L-Trp(6a)和cyclo-L-Trp-L-Tyr(5a)和cyclo-L-Trp-L-Pro(7a)為底物，轉化率分別為(28.5%、28.1%和25.4%)，以cyclo-L-Trp-L-Phe(4a)為底物，轉化率最低(11.8%)。ESI-MS數據分析，分離到的所有產物的分子量均比各自底物的分子量大68，與單異戊烯基的分子量吻合，表明其結構中存在單異戊烯基。將產物1b-7b與底物1a-7a的1H-NMR的比較，證明芳香族質子H-7的雙峰信號消失，而增加異戊烯基的化學位移信號δH3.41-3.54(1H，d，H-1′)，5.24-5.43(1H，t，H-2′)，1.58-1.79(3H，s，H-4′)和1.49-1.75(3H，s，H-5′)，同時H-1′的化學位移H-1′ (δH3.49-3.54)也證明其與芳香族C原子連接[13]。

與已發表的文獻的核磁數據比較，1b和2b的1H-NMR中異戊烯化的吲哚環部分數據與Fan等[14]催化合成的異戊烯化的色氨酸衍生物類似。3b、5b和7b的1H-NMR數據與Wunsch等[15]采用His6-CdpC7PT催化合成的異戊烯化的吲哚二酮哌嗪數據一致。4b和6b的1H-NMR數據與Zou等[16]采用His6-CTrpPT催化合成的異戊烯化的吲哚二酮哌嗪結果基本吻合。這些數據也驗證本研究酶催化產物結構的正確性，合成的化合物經ESI-MS和1H-NMR表征分析，詳細數據如下。

2.3 分子對接結果分析

圖3為1a-7a進行的多組構象中能量最低的構象與受體蛋白(7-DMATS)的對接3D圖，7種目標化合物均很好地結合到蛋白受體中，色氨酸的吲哚環的H原子是共同的活性位點，分別與蛋白受體的GLU89、LEU81等氨基酸殘基形成氫鍵，使受體蛋白與目標底物結合更加牢固，其他氫鍵如表2所示，這也是7-DMATS可以催化底物異戊烯化的原因所在。

分子力學泊松-波爾茲曼表面積(Molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA)法是一種常用于受體與配體分子對接后計算結合自由能值(binding free energy，ΔGbind)的方法[17]，通過4個組分計算結合自由能：范德華力貢獻(ΔGvdw)，靜電貢獻(ΔGele)，去溶劑化極性部分(ΔGpolar)和非極性貢獻(ΔGnonpolar)，ΔGbind值越低說明受體與配體之間的親和力越高[18]。吲哚二酮哌嗪1a-7a和 7-DMATS進行分子對接和優化后，結合情況見圖3，對接復合物的計算結合自由能見表1，通過pymol統計1a-7a和7-DMATS相互作用的疏水氨基酸殘基見表1。

表1 配體與7-DMATS靶點殘基作用情況Table 1 Relations between ligands and residues of 7-DMATS

遵循對接能量ΔGbind低，結合鍵的數量和類型的原則，可以得出7-DMATS對目標底物的催化效果為3a>6a>5a>7a>1a>2a>4a，而合成試驗中1b-7b的產率排序為3b(30.2%)>6b(28.5%)>5b(28.1%)>7b(25.4%)>1b (23.6%)>2b(20.2%)>4b(11.8%)。試驗數據和分子對接模型分析的吻合性，也證實這一對接模型的準確性，為進一步7-DMATS的酶催化反應提供一定的預測模型。此外，從結構來看，組成底物二酮哌嗪的除色氨酸的另一個氨基酸取代基為異丙基(3a)，其分子對接效果最佳，這可能由于其空間位阻小，易于進攻受體蛋白的原因，取代基為苯基(4a)時，分子對接效果最差，這與分子間存在較大的空間位阻有關。

2.4 抗腫瘤活性分析

抗腫瘤活性結果表明(表2)，吲哚環上的異戊二烯基明顯導致細胞毒性的增加，非異戊烯化的吲哚二酮哌嗪對3種癌細胞(人源性宮頸癌細胞HeLa，人源性肺癌細胞A549，人源性乳腺癌細胞 MCF-7)的IC50值>100 μmol·L-1(試驗設置的最高濃度)，而所有測試的異戊烯化的酶產物對3種細胞系的毒性都比原底物高。對 MCF-7的IC50值在中低微摩爾范圍內，而對HeLa和A549細胞的IC50則在較高微摩爾范圍內，特別是化合物cyclo-L-7-dimethylallyl-Trp-L-Pro(7b)對給定的細胞系均顯示出最高的細胞活性，表明7b中的脯氨酸部分組成的吡咯環有助于提高腫瘤細胞的抑制活性。

表2 吲哚二酮哌嗪(1a-7a)以及異戊烯化吲哚二酮哌嗪(1b-7b)的抗癌細胞增殖活性IC50值Table 2 IC50 values of non-prenylated and prenylated tryptophan-containing cyclic dipeptides against HeLa，A549，and MCF-7 cell lines μmol·L-1

2.5 最優酶催化條件分析

對活性最高的產物cyclo-L-7-dimethylallyl-Trp-L-Pro(7b)的7-DMATS的酶催化合成最佳反應條件進行優化(圖4)，為了更準確反應出影響酶反應的因素，首先確定酶促反應最佳時間為16～18 h，積累反應時間達到18 h以上，時間積累量對轉化率影響不大，確定后續反應時間采用18 h。酶反應的影響因素試驗結果反應出 7-DMATS的酶活性受溫度和pH的強烈影響，最佳反應溫度為35 ℃左右，在高于40 ℃時，活性迅速下降，最佳pH控制在8.0左右(Tris-HCl緩沖液)。而7-DMATS活性對二價金屬離子呈現出強依賴性，測試的不同的二價陽離子對于終產物的轉化率偏差很大，影響順序為Mg2+>Ca2+>Mn2+>Fe2+>Ba2+>Zn2+，而在Cu2+存在條件下未檢測到產物，這一結果與已報道的異戊烯化的黃酮的反應類似[19]。

3 結 論

本研究以L-色氨酸系的7個二酮哌嗪為底物(1a-7a)，經7-DMATS催化合成7個異戊烯化的吲哚二酮哌嗪(1b-7b)，通過合成率和HPLC分析，可以發現7-DMATS對底物有一定的選擇性，利用分子對接分析7-DMATS對底物選擇性催化的原因，也驗證酶催化效率的差異性；采用MTT法測定1b-7b對3種腫瘤細胞(HeLa、A549、MCF-7)的抑制活性，7個異戊烯基化的吲哚二酮哌嗪表現出一定的抑制腫瘤細胞的活性，其中確定7b的活性最高，單因素法得出其最佳酶催化條件為：反應時間18 h，溫度為35 ℃，pH為8.0(Tris-HCl緩沖液)，添加5 mmol·L-1的MgCl2。這些結果為后續酶催化合成更多位點的異戊烯基化的吲哚二酮哌嗪提供基礎數據。

近年來，利用芳香族異戊烯基轉移酶的酶催化合成法獲得一系列異戊烯基化的吲哚類生物堿，此途徑可作為化合物修飾的新策略。但是，酶催化合成法對于底物的特異性以及酶促反應條件都有著嚴格的要求。目前，很多學者普遍采用增加酶量，延長反應時間，達到有效合成化合物的目的，筆者的研究證實，這些條件都有著一定的局限性。提升產率的更精確方案，應該建立多因素試驗統計模型[20]去進一步探索，這也是筆者進一步研究的方向。