連作對馬鈴薯酚酸類自毒物質及根際真菌群落的影響

龔 靜，馬海艷，鄭順林,2，向竹清，熊 湖，黃 強，方小婷

(1.四川農業大學，農業部西南作物生理生態與耕作重點實驗室,成都 611130；2.農業部薯類作物遺傳育種重點實驗室，成都久森農業科技有限公司,四川新都 610500)

馬鈴薯成為中國第四大主糧后，需求量增加，與可選倒茬作物低效益間的矛盾導致連作障礙越發明顯[1]。自毒物質積累和根際微生物群落結構的改變是導致連作障礙發生的兩個重要因素[2-3]。目前，烤煙[4]、花生[5]、甜茶[6]、三七[7]等作物中證實對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸等化合物為主要的自毒物質，連作后土壤中細菌數量下降，真菌數量增加[8]，包括青霉、曲霉、鐮霉、粉孢霉等非病原性腐生菌及寄生性菌[9]。土壤中自毒物質與微生物存在一定相關性[10]，研究表明，酚酸積累促進了人參銹腐病菌菌絲生長，使人參爆發銹腐病[11]，其通過改變微生物數量和種群的結構間接影響植物生長[12]，造成經濟損失。目前連作條件下馬鈴薯根際土壤中酚酸類物質及真菌群落間的相關性還有待進一步研究。本研究采用HPLC法和高通量測序技術，研究了不同連作季馬鈴薯根際土壤中化感物質與真菌群落的變化以及分析二者的相關性，旨在對馬鈴薯連作下根際土壤中化感類物質及微生物群落變化有更深刻的認識，為西南地區馬鈴薯生產及農田生態系統可持續性發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為‘費烏瑞它’，選取30～45 g均勻一致的原種做種薯。

1.2 試驗設計

于2017 年8 月下旬至2019 年8 月上旬在四川農業大學三教樓頂溫棚開展盆栽試驗，土壤以蛭石與珍珠巖3∶1(體積比)進行配比，試驗盆規格為37 cm×37 cm×24 cm，每盆4 kg基質土。采用單因素隨機區組試驗設計，在連作1 季的土壤上繼續種植第2 季，連作2 季的基礎上繼續種植第3 季(LZ3)，以此類推，連續種植5 季，每季重復12 次，共計60 盆，具體試驗設計見表1。每季馬鈴薯收獲后清理盆內土壤中殘體、殘根，待出苗約1 cm施加改良赫格蘭德營養液提供植株營養，每4 d一次，直到馬鈴薯塊莖形成期，期間管理同當地大田管理。

表1 試驗設計Table 1 Experimental design

1.3 采樣方法及測定指標

于連作5 季時馬鈴薯塊莖成熟期采用抖根法收集種植1、3、5 季根際土壤(0～20 cm)，將根系完整取出后，抖落并棄去與根系聯系較松的土壤，再用小刷子輕輕將與根系密切接觸的土壤刷入到采樣袋中，混合均勻后用無菌塑封袋分裝為2 份，一份保存于-80 ℃冰箱，用于高通量測序；一份風干后用于酚酸測定。

采用高效液相色譜法(HPLC)測定土壤中酚酸含量及種類，具體參考熊湖等[13]的測定方法，略有改進；總酚含量采用福林酚比色法[14]測定；土壤pH采用電位法[15]；真菌群落測定由上海微分基因公司完成測序。

1.4 數據處理與分析

真菌群落分析參考上海微分基因公司數據處理方法，其他采用Excel 2007進行數據分析，DPS 5.0進行方差分析(LSD法)。

2 結果與分析

2.1 連作對馬鈴薯根際土壤中酚酸類物質的 影響

表2可知，對羥基苯甲酸與阿魏酸含量呈上升趨勢，丁香酸、香豆酸和總酚含量呈先上升后下降趨勢，土壤pH不斷下降。其中LZ5處理下對羥基苯甲酸與阿魏酸含量顯著(P<0.05)高于LZ1和LZ3；丁香酸與香豆酸含量在LZ3時顯著(P<0.05)高于LZ1和LZ5；LZ3和LZ1間總酚含量達顯著差異；LZ5土壤pH顯著低于LZ1和LZ3。因此，連作對馬鈴薯根際土壤中酚酸和土壤pH有較為顯著的影響。

表2 馬鈴薯根際土壤中酚酸類物質含量及Table 2 Content and pH of phenolic acids in potato rhizosphere soil mg·g-1

2.2 馬鈴薯連作對根際土壤中真菌群落的影響

2.2.1 測序結果分析 對9 個連作根際土壤進行質控后得到408 251個優質序列，在97%相似度下進行OTU聚類后得到1 584 個OTUs。

由圖1可以看出，3個處理中OTU總數分別為251 個、310 個、219 個，共780 個。其中LZ1和LZ3共有OTU種類151 種，與LZ5共有114 種，LZ3和LZ5共138 種，3 個根際土壤中共同OTU種類為93 個，表明不同連作處理間的組成和結構存在著差異。

2.2.2 土壤真菌多樣性 由表3可知，Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數趨勢一致，均為先增加后下降，Observed Species指數呈現先下降后升高的趨勢。LZ3處理下Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數與LZ5差異不顯著，顯著高于LZ1；LZ3時Observed Species指數顯著(P<0.05)低于其他兩季。因此，不同連作下真菌多樣性差異較大。

表3 馬鈴薯根際土壤中真菌多樣性Table 3 Fungi diversity in potato rhizosphere soil

2.2.3 土壤真菌群落結構 篩選出豐度排名前20真菌進行統計分析，連作土壤中共檢出6 個真菌門群落(表4)，包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、絲孢菌門(Mortierellomycota)、小孢子菌門(Calcarisporiellomycota)、毛霉門(Mucoromycota)、球囊菌門(Glomeromycota)，子囊菌門不同連作處理占比均高于80%，LZ1檢測出小孢子菌門，LZ5中未檢測出球囊菌門。

表4 馬鈴薯根際土壤中真菌群落結構及豐度Table 4 Community structure and abundance of fungi in potato rhizosphere soil %

LZ1的優勢菌為節叢孢屬，占比為62.68%，其次為被孢霉屬、枝孢霉屬、鐮刀菌屬；節叢孢屬、枝孢霉屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬為LZ3的優勢菌屬，分別占比19.49%、17.89%、17.64%、14.60%、9.41%；LZ5時盤菌屬為優勢真菌，占比達69.37%，其次為璉格孢屬、枝孢霉屬、其他未知菌，表明LZ1和LZ3間真菌群落組成類型相似，但比例差異較大，而LZ3與LZ5間組成差異較大。

2.2.4 土壤真菌群落的主成分(PCoA)分析 采用主成分法分析不同連作處理土壤真菌群落組成結構及距離差異(圖2)。結果顯示，2 個主成分的方差累積貢獻率為88.41%，第一軸(PC1)解釋樣品中63.83%的變量，第二軸(PC2)解釋了 24.58%的變量。LZ1、LZ3、LZ5分別分布在第三、二、四象限，LZ3和LZ1間橫坐標間距離較短，進一步證明這兩季間差異較小，群落結構相似，與LZ5分布較遠，群落結構差異較大，說明不同連作條件對土壤中真菌群落結構組成的影響差異明顯，連作3 季可能是連作障礙發生的臨界點。

2.3 相關性分析

通過對屬水平下優勢菌種豐度與根際土壤中酚酸及pH進行相關關系分析(表5)，丁香酸與被孢霉屬之間存在顯著(P<0.05)正相關關系，與璉格霉屬之間存在極顯著(P<0.01)正相關關系；香草酸與盤菌屬之間存在極顯著(P<0.01)正相關關系，與被孢霉屬之間存在顯著(P<0.05)正相關關系；阿魏酸與節叢孢屬之間存在顯著(P<0.05)正相關關系，與盤菌屬之間存在顯著(P<0.05)負相關關系。

表5 屬水平下優勢菌種豐度與土壤酚酸含量及pH的相關性Table 5 Correlation between abundance of dominant strains and content and pH of soil phenolic acid at genus level

3 討 論

3.1 連作對馬鈴薯根際酚酸類物質的影響

前人在西瓜[16]、西洋參[17]連作土壤中證明棕櫚酸、香豆酸等多種酚類化合物的積累是作物連作障礙產生的重要原因之一[18]。本研究中，連作根際土壤檢測出對羥基苯甲酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸等4種酚酸，連作后對羥基苯甲酸、阿魏酸不斷增加，丁香酸、香豆酸在連作3 季達到最大值，總酚含量反應一致，說明引起馬鈴薯連作障礙的酚酸不一定含量高，可能是丁香酸或其他未發現的酚酸，還有待進一步研究，連作后根際土壤pH下降，土壤酸化，病原菌滋生，植物抵御病蟲害的能力下降[19]。

3.2 連作對馬鈴薯根際土壤中真菌群落的影響

土壤微生物多樣性是土壤環境的健康狀況的重要指標[20]。本研究顯示，土壤中真菌多樣性隨連作加深呈先增加后下降的趨勢，這與在丹參、花生、煙草等連作土壤中真菌多樣性研究一致[21-23]，與大豆[24]不一致，但與丁香酸、香豆酸趨勢相同，推測可能和這些根際分泌物積累變化有關。

某些特定植物病原微生物富集會引起作物感病，如鐮刀菌富集后引起花生的根腐病[25]。本研究表明，連作土壤中子囊菌門為優勢種群。節叢孢屬同為連作1 季與連作3 季優勢菌群，兩季的真菌結構類似，連作5 季的優勢真菌主要為盤菌屬，也包括引起馬鈴薯塊莖腐病的鐮刀霉屬和早疫病的璉格孢霉屬，說明連作改變了土壤真菌群落結構，連作3 季可能是一個臨界點，在此之后有害真菌豐度增加，真菌群落結構的失衡后有害真菌富集也是連作障礙產生的重要因素。

自毒物質的積累與土壤微生物存在密切的聯系[26]。根際微生物對根際分泌的自毒物質代謝和降解使其發生改變，進一步影響土壤微生物的種類和分布[27]。本研究中酚酸類物質與真菌群落結構關系密切，不同類型真菌豐度群落對不同酚酸的反映不一致，丁香酸、香豆酸、阿魏酸對鏈格孢屬、被孢霉屬等真菌豐度表現為正相關性，可能是這幾種酚酸為微生物提供了能源，加快了新陳代謝，增加了微生物數量[28]，如苯甲酸、肉桂酸增加了枯萎病的發病幾率[29]。阿魏酸與盤菌屬間表現為負相關，可能是因為阿魏酸不是盤菌屬的主要碳源，因此不利于該類真菌的繁殖。綜上，馬鈴薯根際分泌物改變了根際真菌群落結構。

4 結 論

馬鈴薯連作后根際土壤中4 種酚酸類物質趨勢不同，阿魏酸、對羥基苯甲酸在連作5 季含量最高，丁香酸、香豆酸含量在連作3 季最高。

連作改變根際微生物群落，使真菌多樣性增加，連作3 季后具有最高多樣性，連作增加了病菌的數量和豐度，連作5 季的優勢菌包括盤菌屬、鐮刀菌屬和璉格孢霉屬，而連作1 季和3 季間真菌結構更相似。

綜上所述，連作3季為連作障礙發生的臨界點，而根際自毒物質和土壤微生物群落的改變存在關聯性，為今后緩解馬鈴薯連作障礙提供了理論依據。