不同產地的兩種橙色大白菜類胡蘿卜素積累差異分析

馬 帥，王若凡，陳 霖，孟 艷，盧倩倩，張魯剛

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

大白菜(BrassicarapaL.spp.pekinensis)是十字花科蕓苔屬重要的蔬菜作物之一，大白菜葉球內葉顏色有白色、黃色和橙色。其中，橙色大白菜吸引了消費者和育種者的興趣，因為其維生素C、類胡蘿卜素及礦質元素含量均高于常見的白色大白菜[1-2]。類胡蘿卜素是萜類色素物質，在生物體內通過類異戊二烯途徑合成，呈現黃色、橙紅色和紅色。橙色大白菜正是積累了類胡蘿卜素使葉片表現出橙色[3]，這種類胡蘿卜素主要是前番茄紅素和光異構而形成的番茄紅素[4]，而番茄紅素異構酶(CRTISO)是番茄紅素合成的關鍵酶基因。有報道發現BrCRTISO功能的缺失會導致大白菜中前番茄紅素的積累，并使大白菜內葉呈現橙紅色[5]。類似現象在其他園藝作物中也報道，Li 等[6]發現花椰菜中通常含有少量的類胡蘿卜素，但橙色花椰菜中由于Or基因的突變積累了較多的β-胡蘿卜素。Arango等[7]對橙色胡蘿卜和白色胡蘿卜的研究發現，CYP97A3基因功能的缺失導致橙色胡蘿卜中大量積累α-胡蘿卜素。陳奕聰等[8]發現紅色品種辣椒中的辣椒紅素含量顯著高于紫色品種辣椒。有報道證明南瓜中CHYB影響葉黃素和紫黃質的合成，LYCE影響類胡蘿卜素含量[9-10]。

類胡蘿卜素在植物生長發育中有著多種重要的作用，如光吸收、光保護，作為脫落酸、獨腳金內酯等植物激素的合成前體，同時類胡蘿卜素在人體營養和健康方面也有著重要的作用，如β-胡蘿卜素是維生素A的合成前體，葉黃素、番茄紅素等可以增強人體的抗氧化能力，預防一些癌癥，葉黃素、玉米黃質可以減緩與年齡相關的視網膜損害等[11-14]。因此培育高胡蘿卜素蔬菜及研究類胡蘿卜素積累機理有重要的實際意義和理論價值。

盡管在植物中類胡蘿卜素的生物合成代謝途徑已比較清楚，也已明確有些酶在類胡蘿卜素積累中發揮著重要作用，如八氫番茄紅素合成酶(PSY)、番茄紅素ε-環化酶(LYCE)、番茄紅素β-環化酶(LCYB)、β-胡蘿卜素羥化酶(CHYB)、類胡蘿卜素異構酶(CRTISO)等。但有關不同地域條件下的植物類胡蘿卜素積累方面的研究報道很少。Tuan等[15]發現光照條件下生長的大白菜中類胡蘿卜素總量明顯高于黑暗中生長的，且接受光照的大白菜外葉的類胡蘿卜素總量是內葉和中葉的30倍。不同地域除了光照條件，光質、溫度等也是重要環境因子，因此地域條件對植物類胡蘿卜素合成積累的作用應該是多種因素的綜合作用，它對發現類胡蘿卜素特異積累地區及其栽培條件有重要參考價值。

本研究以兩種橙色大白菜為材料，研究了不同地區種植下橙色白菜葉球的類胡蘿卜素積累特點。以期了解兩種橙色大白菜類胡蘿卜素成分及含量在不同地域的差異、探索遺傳背景和環境條件對其影響，從而為進一步研究環境因素調控類胡蘿卜素的形成奠定基礎、為選擇橙色大白菜類胡蘿卜素積累最適宜種植的地區提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

橙色大白菜‘14雜1’和‘15雜22’種子由西北農林科技大學園藝學院十字花科課題組提供。2018年分別在陜西延安、閻良、漢中、楊凌，山西太原，河南鄭州，湖北武漢，四川成都等地示范生產。待葉球成熟后取樣，測定單株質量和葉球質量，隨機選擇3棵成熟葉球，取葉球從外向內數第7片葉的軟葉部分3 g存放于離心管，于真空冷凍干燥儀中進行凍干后，放在-80 ℃貯藏，用于類胡蘿卜素的提取及組分分析。

1.2 儀器和試劑

儀器：高速冷凍離心機，高效液相色譜儀(島津，日本)，真空冷凍干燥儀，旋轉蒸發儀等。

試劑：甲醇、乙腈(TEDIA，美國)，甲基叔丁基醚(Aladdin，美國)，乙醇、丙酮、二丁基羥基甲苯等。

1.3 方 法

1.3.1 番茄紅素異構酶基因突變體的檢測 利用橙色大白菜番茄紅素異構酶突變體Brcrtiso基因的3′端插入片段設計的特異引物[16]擴增檢測‘14雜1’和‘15雜22’是否為攜帶Brcrtiso基因突變體，若是突變體則會出現一條53 bp的條帶，說明攜帶該基因，反之則不是攜帶該基因的突變體。上游引物(F)：5′-CAGAAACATCAGGGTTGAAATC-3′ ，下游引物(R)：5′-TTACTGCCGAAAGCGAAA-3′。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取 將凍干后的白菜葉片研磨并加入5 mL類胡蘿卜素提取液[V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1 ]充分混勻后，提取70 min，取出后12 000 r/min離心10 min，重復操作兩次后合并上清液。將上清液置于圓底燒瓶中進行 35 ℃的減壓蒸干，并用1 mL乙酸乙酯進行溶解，溶解后經0.22 μm濾器過濾到1.5 mL棕色進樣瓶中等待上機檢測(凍干過程應該避光)。

1.3.3 類胡蘿卜素主要成分的定性和定量分析 采用高效液相色譜法測定類胡蘿卜素組分，色譜檢測系統為：LC-2010 型高效液相色譜儀(日本島津)，自動進樣器，紫外檢測器，C30 柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長為450 nm，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，樣品進樣量為 20 μL；流動相A：V(甲醇)∶V(MTBE)∶V(水)=85∶12∶3，流動相B：V(甲醇)∶V(MTBE)∶V(水)=12∶84∶4，各加體積分數0.01% BHT。洗脫方法參照陳鵬飛等[17]、李佩榮等[18]的方法。洗脫條件為0.01～1.01 min：A-B(99∶1)；1.01～24.01 min：A-B(82∶18)；24.01～ 65.01 min：A-B(42∶58)；65.01～75.01 min：A-B(18∶82)；75.01～ 77.01 min：A-B(18∶82)；77.01～78.01 min：A-B(99∶1)。

1.3.4 橙色大白菜類胡蘿卜素合成相關基因的表達分析 根據兩個橙色大白菜葉球類中檢測的胡蘿卜素組分情況，進一步分析Br-PSY、Br-Brcrtiso、Br-LYCB、Br-LYCE、Br-CHYB基因的表達水平。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence used inreal-time fluorescence quantitative PCR

RT-qPCR反應體系為20 μL，其組分比例如下：10 μL 2× RealStar Green Power mixture(TaKaRa，日本) 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板cDNA(100 ng/μL)2 μL，雙蒸水7 μL。擴增程序如下：95 ℃預變性10 min；PCR擴增反應：95 ℃變性5 s；58 ℃退火1 min；72 ℃延伸30 s，循環數為40；熔解曲線：58 ℃，10 s，循環數為75。所有數據均在鮮質量下測定，每個樣品包含3次技術重復和3次生物學重復，計算不同樣品的Ct值，采用2-ΔΔCt算法計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 兩個橙色大白菜品種中番茄紅素異構酶基因突變體的檢測

圖1是用橙色大白菜番茄紅素異構酶突變體Brcrtiso基因的特異引物[16]擴增‘14雜1’和‘15雜22’的DNA的結果，可以看出兩個品種均擴增出大小為530bp的條帶，說明兩個橙色大白菜品種都攜帶Brcrtiso基因，為橙色突變體。

2.2 兩個品種在不同產地生育期及葉球質量比較

從表2可以看出，‘14雜1’在武漢地區的葉球質量最大，凈質量達到6.25 kg ；在太原地區葉球質量最小，凈質量只有1.55 kg，相差4倍。同樣，‘15雜22’也是在武漢地區的葉球質量最大，凈質量達到5.03 kg ；在太原地區葉球質量最小，凈質量只有1.1 kg，相差4.6倍。可見，不同地區提供的生長條件對這兩個橙色大白菜葉球的生長有著至關重要的作用。另外，筆者發現在所選擇的8個供試地點中，‘14雜1’的葉球質量均高于‘15雜22’，這說明‘14雜1’的生長勢強于‘15雜22’。

表2 兩個品種在不同地區的生育期及葉球質量Table 2 Growth period and leaf-head mass of two varieties in different areas

2.3 不同產地種植的兩個品種中類胡蘿卜素的含量差異及分析

不同產地‘14雜1’和‘15雜22’兩個品種中均檢測出α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素以及少量的番茄紅素。圖2為武漢地區的兩個品種葉球的高效液相色譜圖。

2.3.1 α-胡蘿卜素的含量差異及分析 由圖3可以看出，‘14雜1’和‘15雜22’這兩個品種葉球在不同產地的α-胡蘿卜素含量差異明顯，但趨勢相同，‘14雜1’葉球α-胡蘿卜素含量高于‘15雜22’。其中，‘14雜1’在閻良地區的α-胡蘿卜素含量最高，達到26.15μg/g；在鄭州地區的含量最低，為15.00 μg/g。‘15雜22’在閻良地區的α-胡蘿卜素含量也最高，達到24.37 μg/g；在延安地區的含量最低，為10.28 μg/g。各個地區中‘14雜1’的α-胡蘿卜素含量均高于‘15雜22’，說明遺傳背景對α-胡蘿卜素的積累有相對穩定的作用，同時不同地方生產的兩個品種葉球的α-胡蘿卜素含量差異明顯，說明生長條件對α-胡蘿卜素的積累有重要作用。

2.3.2 β-胡蘿卜素的含量差異及分析 由圖4可以看出，不同產地的‘14雜1’和‘15雜22’兩個品種葉球的β-胡蘿卜素含量差異較小，與α-胡蘿卜素相比較，兩個品種中β-胡蘿卜素的含量都低于α-胡蘿卜素含量。其中‘14雜1’在閻良地區的β-胡蘿卜素含量最高，達到8.55 μg/g；在武漢地區含量最低，為7.80 μg/g。‘15雜22’在閻良地區的β-胡蘿卜素含量最高，達到9.18 μg/g；在延安地區含量最低，為7.39 μg/g。除了閻良，在其他地區也表現出‘14雜1’葉球的β-胡蘿卜素含量高于‘15雜22’的現象，但差異較小。總體而言，β-胡蘿卜素含量表現為‘14雜1’和‘15雜22’品種間差異不明顯，不同地區間差異也不明顯，這一方面說明‘14雜1’和‘15雜22’的遺傳背景對β-胡蘿卜素含量具有相同影響，另一方面說明這幾個栽培地方的條件對β-胡蘿卜素含量沒有顯著影響。

2.3.3 番茄紅素的含量差異及分析 圖5可以看出，不同地區‘14雜1’和‘15雜22’兩個品種葉球的番茄紅素含量差異很大，而且兩個品種在不同地方表現也不一致。在‘14雜1’葉球中，只有在閻良、鄭州、武漢、成都4個地區生產的葉球檢測出番茄紅素，在延安、太原、漢中、楊凌4個地區沒有檢測出番茄紅素。在‘15雜22’葉球中，除了太原地區沒有檢測到番茄紅素，其余地區均有不同含量的番茄紅素。其中，‘14雜1’在武漢地區的番茄紅素含量最高，達到23.26 μg/g；在閻良地區含量最低，為0.57 μg/g，相差40倍；‘15雜22’在武漢地區的番茄紅素含量最高，達到22.78μg/g；在閻良地區含量最低，為3.35 μg/g，相差6.8倍。番茄紅素是橙色大白菜的特有色素。總體而言，番茄紅素含量表現為‘14雜1’和‘15雜22’品種間差異顯著、不同地區間差異顯著，特別是品種與地區間互作差異顯著，說明影響‘14雜1’和‘15雜22’葉球番茄紅素含量的因素，除了遺傳背景和栽培地方的條件外，基因型與栽培條件的互作尤為重要。

2.4 不同產地種植的兩個橙色大白菜品種葉球中胡蘿卜素合成相關基因表達分析

根據‘14雜1’和‘15雜22’兩個品種葉球中檢測到的類胡蘿卜素成分，進一步檢測胡蘿卜素合成相關基因(PSY、LYCE、LYCB和CRTISO、CHYB)表達情況。

PSY基因是類胡蘿卜素代謝的限速酶基因[19]，表達分析表明，同一品種不同地區生產的橙色大白菜葉球的PSY基因的表達水平差異明顯，同一地區不同品種PSY基因的表達水平的差異因地區不同而異。以楊陵的‘14雜1’為標準，除了成都的‘14雜1’、楊凌的‘15雜22’中相對表達量下調外，其他地區兩個品種PSY基因的表達水平均上調，而且‘15雜22’中的上調幅度大于‘14雜1’，尤其是在延安、閻良、漢中和成都‘15雜22’中的上調幅度更大(圖6)，說明‘15雜22’中的類胡蘿卜素代謝流較‘14雜1’強。

LYCE催化番茄紅素轉化為α-胡蘿卜素。品種比較而言，不同地方的‘15雜22’中的表達整體低于在‘14雜1’，這與α-胡蘿卜素含量的趨勢一致。兩個品種在不同地方的表達規律不同，‘14雜1’表現為在楊凌、成都、漢中的葉球中表達水平較低，在鄭州、延安、太原地區的葉球中表達量較高，可達到楊凌地區的2～6倍；‘15雜22’表現為在太原、鄭州、武漢、成都的葉球中表達量最低，在閻良、楊凌地區的葉球中表達中等，在延安、漢中的表達最大。

LYCB催化番茄紅素轉化為β-胡蘿卜素。品種比較來看，兩個品種在延安、閻良、鄭州、楊凌4個地方的表達差異不顯著，在太原、武漢、成都、漢中4個地方的表達差異顯著，這與β-胡蘿卜素含量的趨勢不一致。兩個品種在不同地方的表達規律各有特點，在各地區的‘14雜1’中相對表達量差異不大，其中在太原、武漢地區樣本中相對表達量較高；在延安、閻良、鄭州、楊凌、成都、漢中地區相對表達量低且差異不大。LYCB在各地區的‘15雜22’中的相對表達量差異較大，其中在楊凌的表達水平最低，在成都的表達水平最高。

CRTISO催化前番茄紅素轉化為前番茄紅素。品種比較來看，除了楊凌、太原和武漢，其他5個地方的表達都是‘15雜22’高于‘14雜1’，這與番茄紅素的含量趨勢基本一致。但是兩個品種在不同地方的表現各不相同，‘14雜1’中相對表達量是太原地區的最高，在成都、漢中、楊凌的相對表達量較低，在延安地區樣本未檢測到表達；‘15雜22’中相對表達量表現為延安地區的最高，達到最低表達水平楊凌地區該樣本的10倍。

CHYB催化植物中β-胡蘿卜素經中間產物β-黃素合成玉米黃素的過程。品種比較來看，兩個品種的表達沒有規律。不同品種在不同地方的表達各有特點，在‘14雜1’中相對表達量在武漢、太原地區較高，在鄭州、閻良、楊凌、成都、漢中表達量較低，延安沒有檢測到表達；在‘15雜22’中相對表達量表現為漢中地區的最高，鄭州地區表達最低。兩品種表達差異顯著的地區是延安、成都、漢中、太原，其中延安、成都、漢中都是‘15雜22’的相對表達量高于‘14雜1’，而太原表現 相反。

3 結論與討論

3.1 不同橙色大白菜品系和品種葉球的類胡蘿卜素含量

有關橙色大白菜類胡蘿卜素種類及含量的差異分析研究較少。陳鵬飛等[20]在橙色大白菜自交系160、161中檢測到了番茄紅素、β-胡蘿卜素及葉黃質混合物，未檢測到α-胡蘿卜素。張俊祥等[4]報道在橙色葉球大白菜自交系中主要積累前番茄紅素和番茄紅素及少量的γ-胡蘿卜素，但是沒有檢測到β-胡蘿卜素和葉黃素。李娟[21]測定了橙色大白菜雜交種‘金冠1號’和‘金冠2號’葉球中類胡蘿卜素成分和含量，在兩個品種中均檢測到葉黃素、番茄紅素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素，進一步分析表明‘金冠1號’β-胡蘿卜素含量比‘金冠2號’低，葉黃素、番茄紅素、α-胡蘿卜素都較‘金冠2號’高。‘金冠1號’中的葉黃素、番茄紅素、α-胡蘿卜素及‘金冠2號’中的葉黃素在植株結球過程中整體呈下降趨勢。‘金冠2號’的番茄紅素含量在結球期先下降后上升，整體含量有所提高。‘金冠1號’中的β-胡蘿卜素和‘金冠2號’中的α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素在結球期先上升后下降。

本研究中，對種植在不同地區的兩個橙色大白菜新品種所積累的類胡蘿卜素成分及含量進行分析，結果在兩個品種中均檢測到α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和番茄紅素，進一步分析發現兩個品種中β-胡蘿卜素的含量在品種間差異不明顯。在所有產地中，兩個品種中β-胡蘿卜素的含量均低于α-胡蘿卜素含量，且在這兩種類胡蘿卜素含量上，幾乎所有的‘14雜1’均高于‘15雜22’。在兩個品種中也檢測到較少量的番茄紅素，其含量與地區相關。在山西太原地區種植的兩個品種中未檢測出番茄紅素，在武漢地區種植的兩個品種中番茄紅素含量均顯著高于其他地區，結合兩個地方的葉球生長情況，武漢地區種植的兩個品種葉球堅實，單球分別達到6.25 kg和5.03 kg,而太原地區種植的兩個品種葉球緊實度低，單球分別為1.55 kg和1.1 kg，可能說明番茄紅素在葉球發育后期積累、且與葉球緊實度有關。比較兩個供試品種，在其他6個地區中‘15雜22’的番茄紅素含量均高于‘14雜1’，這與α-胡蘿卜素含量相反，這與兩種成分位于同一代謝通路相一致。

與前人研究比較看出，不同橙色大白菜其葉球類胡蘿卜素的組分和含量有所差異，其主要原因可能與所選擇的供試材料遺傳背景不同有關，如有的研究者采用的試驗材料是各自的自交系材料[4，17]，有的是雜交種材料。不同自交系間其遺傳背景不同，由于親本遺傳背景不同、其雜交種遺傳結構必然不同。筆者在育種實踐也發現不同橙色大白菜自交系的球葉顏色也有深淺之分，說明不同橙色大白菜雖然帶有相同的突變基因Brcrtiso，由于遺傳背景不同，其葉球類胡蘿卜素的組分和含量有所不同，因此可能還存在其他調控類胡蘿卜素代謝的因子，有待進一步研究。

3.2 不同產地的橙色大白菜葉球中類胡蘿卜素組分與含量

關于類胡蘿卜素成分及含量與環境間的關系，也有不少研究。Adalid等[22]發現在大田栽培的野生櫻桃番茄的雄性親本β-胡蘿卜素含量高于保護地栽培，母本則相反，其F1、F2代的在保護地栽培β-胡蘿卜素含量高于大田栽培，這些結果表明該品種的β-胡蘿卜素積累特性可能受基因型和環境相互作用的影響。Wimalasiri等[23]發現不同氣候的不同國家種植的同一品種苦瓜具有不同的類胡蘿卜素含量，這可能是由于溫度、海拔、降水量3個因素通過影響類胡蘿卜素代謝途徑進一步影響了類胡蘿卜素含量。Salvador等[24]通過相關性分析發現當地櫻桃型番茄β-胡蘿卜素的積累表現出非常高的基因型和環境相互作用的結果。李娟[21]對不同地區生產的橙色大白菜‘金冠1號’和‘金冠2號’葉球中類胡蘿卜素成分和含量進行分析，結果發現甘肅定西生產的‘金冠1號’中未檢測出葉黃素和番茄紅素，β-胡蘿卜素含量也較低，α-胡蘿卜素含量較高，但低于同地區生產的‘金冠2號’，也低于陜西生產的‘金冠1號’；而甘肅定西生產的‘金冠2號’中未檢出番茄紅素，葉黃素含量很低，β-胡蘿卜素含量較高，但低于陜西的‘金冠2號’，而α-胡蘿卜素含量很高，并高于陜西的‘金冠2號’大白菜。

本研究發現不同地區生產的‘14雜1’和‘15雜22’這兩個品種葉球的α-胡蘿卜素含量和番茄紅素含量與生產地關系密切，一方面表現為同一品種不同生產地的同一類胡蘿卜素的含量不同，如不同產區‘14雜1’和‘15雜22’的α-胡蘿卜素含量的差異最大達到1.74倍和2.37倍；另一方面表現為同一品種不同類胡蘿卜素與生產地區互作不同，如‘15雜22’的3種類胡蘿卜素含量在不同地區的變化不一致，表現為β-胡蘿卜素含量受栽培環境影響小，α-胡蘿卜素含量在陜西閻良含量最高，武漢最低；而番茄紅素含量與其相反，說明α-胡蘿卜素代謝分支與番茄紅素關系密切。在8個供試地點中，閻良這一地區的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量高于其他地區，可以說明閻良地區所提供的環境條件較其他地區更適于這兩類類胡蘿卜素的積累，而湖北武漢地區生產的橙色大白菜更適于番茄紅素的積累。

前人研究報道往往只分析了一個地方的樣品[25]，不能了解環境要素對類胡蘿卜素積累的影響，本研究對不同地區兩種橙色大白菜類胡蘿卜素的分析，發現遺傳背景和環境因素都是影響橙色大白菜類胡蘿卜素積累的重要因素，這為全面深入研究大白菜類胡蘿卜素積累規律指明了方向，也為橙色大白菜專用功能品種的選育提出了新的課題。

3.3 不同產地的兩個橙色大白菜葉球中類胡蘿卜素積累與相關基因表達的關系

在不同基因型玉米中,LYCE基因的多態性是造成籽粒 β-胡蘿卜素含量差異的主要原因[26-27]。在甘薯塊根中,LCYB是 β-胡蘿卜素合成途徑的關鍵酶基因[28]。在胡蘿卜葉片中，LYCE表達量與葉黃素、總類胡蘿卜素含量之間呈負相關，說明LYCE對葉中主要類胡蘿卜素的積累起著關鍵性作用[29]。劉英明等[30]發現在兩個番茄品種的成熟果實中，PSY基因表達量存在差異，紅果中的表達量高于粉果，且PSY基因在番茄不同組織器官中的表達也具有明顯差異，這說明PSY基因可能在調控番茄果肉顏色形成中起重要作用。本研究對不同地區生長的兩個橙色大白菜新品種葉球類胡蘿卜素合成相關基因表達進行了分析發現，不同地方的‘15雜22’中LYCE的表達整體低于在‘14雜1’，這與α-胡蘿卜素含量的趨勢一致。除了楊凌和太原，6個地方‘15雜22’的CRTISO表達都是高于‘14雜1’，這與番茄紅素的含量趨勢基本一致。而兩個品種的LYCB和CHYB表達沒有規律。相關性分析發現，兩個品種葉球中各種類胡蘿卜素成分含量和總含量與單個基因的表達都沒有達到顯著相關性，說明單個基因表達不是決定類胡蘿卜素含量的主要因素，某種類胡蘿卜素的積累是其合成與轉化及其整體代謝流共同作用的結果，也可能還存在其他未發現的基因參與類胡蘿卜素含量積累。

總體而言，本試驗從兩個橙色大白菜品種葉球產品類胡蘿卜素組分與含量變化分析中發現橙色大白菜類胡蘿卜素代謝受遺傳背景、栽培條件及其互作作用影響的多樣性和復雜性，但具體的環境條件如何從分子水平影響橙色大白菜類胡蘿卜素代謝有待于進一步研究。