葡萄抗寒性與韌皮部糖分及內源激素積累的相關性

韋霞霞，李玉梅，李彥彪，郭艷蘭，賈 進，馬宗桓，毛 娟，陳佰鴻

(1.甘肅農業大學 園藝學院，蘭州 730070；2.武威市林業科學研究院，甘肅武威 733000；3.甘肅紅橋莊園葡萄酒有限公司，甘肅張掖 734200)

葡萄(VitisviniferaL.)作為世界上最古老的果樹樹種之一，種植面積廣。葡萄漿果口感豐富且具有優良的藥用價值和保健功能。北方地區作為中國葡萄主產區，在冬前及冬季，葡萄冷害與凍害時有發生，研究葡萄抗寒的內在調控機理對葡萄產業發展具有重要的理論與實踐意義。植物激素與糖既可作為信號分子來調控植物生長發育的各個階段，同時又是中間代謝產物[1]，研究其含量與葡萄抗寒性的關系意義重大。

國內外對于葡萄抗寒的生理研究有較多報道，其中包括葡萄抗寒性的評價[2]，低溫條件下可溶性糖[3-4]、激素[5]積累等的研究。但尚未明確不同時期葡萄枝條韌皮部中可溶糖及內源激素積累與葡萄抗寒性的關系。目前，已經有研究證實可溶性糖可以作為植物抗寒性的重要物質[6]，植物激素是抗寒基因表達的啟動因素且會在受到低溫脅迫時調節植物來適應逆境[7-8]。可溶性糖是“源”和“庫”中主要的一種物質，也是有機物運輸和暫時儲存的主要形式[9]。低溫脅迫時糖含量的增加可以提高植物細胞的滲透勢，降低水勢，增加植株的保水能力，緩和細胞質過度脫水，使細胞質不致遇冷膠化，從而提高植物的抗寒性[10]。同時，糖可直接作為抗氧化劑來抑制一些氧化物質的產生[11]，來調節植物生長發育和應對不良環境[5]。植物激素能夠調節植物對外界刺激(如溫度、損傷、水分等)產生應激反應，從而應對外界脅迫[12]。比如植物受到冷脅迫時，通常表現出許多的低溫適應性反應，如可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量升高，并且產生較多的脅迫響應激素如ABA(脫落酸)，從而使植物的抗寒性提高[13]。目前，國內外關于糖或者激素與抗寒性的關系有一些報道，比如大葉女貞[14]、平歐榛[15]、薰衣草[16]、棗[17]等，關于葡萄抗逆性的分子生物學也已開展大量研究[18-19]，但關于葡萄不同時期枝條韌皮部中可溶性糖、內源激素與抗寒性的綜合分析鮮見報道。

本試驗以‘左山1號’‘黑比諾’‘101-14’‘3309C’和‘SO4’為試材，研究枝條可溶性糖及內源激素含量與抗寒性的相關關系。旨在為生產實踐提供理論基礎，為葡萄種質的抗寒性鑒定和抗寒砧木篩選提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為抗寒性不同的‘左山一號’‘黑比諾’‘101-14’‘3309C’和‘SO4’。均定植于甘肅省武威市林業科學研究院釀酒葡萄品種園。株行距為0.7 m×3.0 m，淺溝栽植，溝深30 cm，溝寬 80～100 cm，溝長50～70 m，東西行向，單臂籬架整形，架高1.7 m。

1.2 試驗設計

在2019-08-08入秋后開始第1次取樣，每隔24 d取1次，在11月中旬越冬埋土前進行最后一次取樣，共計取樣5次。取樣時間均為8：00—10：00，選取長勢一致的1 a生葡萄枝條帶回實驗室，刮取韌皮部，進行稱量后錫箔紙分裝在液氮中速凍后迅速移至-80 ℃冰箱保存，備用。

每個品種選取10個植株，在10株樹中剪取18個長勢一致的枝條，每6個枝條為一組重復，共計設置3組重復。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 抗寒性鑒定 根據甘肅農業大學園藝學院果樹課題組建立的釀酒葡萄抗寒綜合評價模型對5個葡萄品種寒性進行評價[20-21]。其中相對電導率用 DDS-307A 型電導儀測定[22]，可溶性糖含量用蒽酮法測定[23]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[23]，脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定[23]，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法[23]。

1.3.2 可溶性糖 使用美國Waters Acquity Arc型高效液相色譜儀進行測定。色譜條件為色譜柱：XBridge BEH Amide型色譜柱(4.6 mm×150 mm、2.5 μm)；流動相：75%乙腈+0.2%三乙胺+24.8%超純水(百分數為體積比)；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃。

提取方式：葡萄韌皮部加液氮研磨后準確稱取1.0 g，移至10 mL離心管中，加入5 mL 80%色譜乙醇，35 ℃下超聲提取20 min，12 000 r/min下離心15 min，取上清液。重復提取2次，每次加80%色譜乙醇2 mL，合并上清液，定容至 10 mL。取2 mL于真空離心濃縮儀中旋轉蒸發(60 ℃)至全干，用φ=50%乙腈復溶(超純水配置)，過0.22 μm有機相微孔濾膜至樣品瓶中 待測。

1.3.3 內源激素 使用美國Waters Acquity Arc型高效液相色譜儀進行測定。色譜條件為色譜柱：Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm、5 μm)；流動相：10%甲醇+90%φ=0.1%磷酸；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃。

提取方式為：在避光環境中將葡萄韌皮部加液氮研磨后準確稱取2.0 g，用5 mL 80%的色譜甲醇分3次洗入試管中，用鋁箔紙包裹放4 ℃冰箱中浸提12 h(每隔1 h充分震蕩1次，使激素溶解于有機相)。搖勻后4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，吸取上清置于10 mL離心管中，濾渣再用80%的色譜甲醇浸提2次(每次震蕩混勻)，每次加2.5 mL，浸提1 h，合并濾液并定容至10 mL。取2 mL于真空離心濃縮儀中旋轉蒸發(38 ℃)至全干。用1.0 mL的50%色譜甲醇復溶后過 0.22 μm有機相微孔濾膜至樣品瓶中，待測。

1.4 數據分析

采用Excel 2010進行數據處理和作圖，用SPSS 22.0 進行方差分析與相關性分析。相關系數采用Pearson方式進行計算。葡萄枝條抗寒性評價方式采用模糊數學隸屬函數法，具體公式如下：Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)(正相關)或Uij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)(負相關)。式中：U為抗寒隸屬函數值，X為各品種不同指標的測定值，Xjmin為j指標的最小值，Xjmax為j指標的最大值，i代表品種，j代表指標。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄品種的抗寒系數及抗寒力

如表1所示，5個葡萄品種抗寒性表現為‘左山1號’>‘101-14’>‘3309C’>‘SO4’>‘黑比諾’，綜合抗寒系數(綜合隸屬函數值)分別為 0.954 3、0.818 6、0.791 7、0.635 3和0.366 5。

表1 不同品種各抗寒指標的隸屬函數值Table 1 Subordination value of cold resistance indexes of different cultivars

2.2 不同時期葡萄枝條韌皮部可溶性糖含量

由表2可知，不同葡萄品種可溶性糖含量差異顯著。在8月8日‘黑比諾’與‘左山1號’的蔗糖含量顯著低于其他品種。9月1日蔗糖含量在‘SO4’中最高，‘左山1號’中最低，分別為41.74和28.93 mg/g。在9月25日時‘黑比諾’中蔗糖含量達37.60 mg/g，比其他4個品種高 31.15%～43.46%。在10月19日與11月12日時蔗糖含量在各品種間均具有顯著性差異，為‘左山1號’>‘101-14’>‘3309C’>‘SO4’>‘黑比諾’，且各品種蔗糖含量在11月12日達到最大，分別為66.94、56.59、53.18、45.80和40.20 mg/g。

表2 不同時期5個葡萄品種蔗糖、葡萄糖、果糖含量Table 2 Contents of sucrose,glucose and fructose in five grape varieties in different periods

葡萄糖含量在8月8日以‘101-14’最高，9月1日以‘左山1號’最大且分別比‘101-14’‘3309C’‘ SO4’與‘黑比諾’高35.30%、57.95%、89.22%和71.59%。9月25日時‘左山1號’‘101-14’和‘3309C’間的葡萄糖含量無顯著性差異，但顯著高于‘SO4’和‘黑比諾’。在10月19日與11月12日‘黑比諾’中葡萄糖含量分別為4.27和9.54 mg/g，顯著低于同一時期的其他品種，而‘左山1號’顯著高于其他品種，含量分別為6.53和17.77 mg/g。

‘左山1號’中果糖含量在每一個時期均顯著高于其他品種。10月19日時果糖含量在各品種間均具有顯著差異，含量表現為‘左山1號’>‘101-14’>‘3309C’>‘SO4’>‘黑比諾’，其中‘左山1號’比其他品種依次高出30.99%、42.06%、53.45%和103.24%。11月12日時各品種果糖含量出現大幅度增加且含量達到最大，其中‘左山1號’顯著高于其他品種，而‘黑比諾’顯著低于其他品種，含量分別為15.77和11.28 mg/g。

綜上試驗分析表明，在9月25日之前蔗糖含量在‘左山1號’中較低而‘SO4’與‘3309C’中較高，果糖和葡萄糖含量在‘左山1號’與‘101-14’較高而‘SO4’與‘黑比諾’較低。但在10月19日與11月12日時3種可溶性糖含量從大到小依次為‘左山1號’ ‘ 101-14’‘3309C’‘ SO4’和‘黑比諾’，這一規律與抗寒系數排列順序完全一致。

2.3 不同時期葡萄韌皮部內源激素含量

如表3所示，不同葡萄品種內源激素含量差異顯著。‘黑比諾’中ABA含量在每個時期均顯著低于其他品種。在8月8日與9月1日ABA含量在‘101-14’中分別為5.43和4.67 μg/g，均顯著高于同一時期其他品種。在9月25日之后‘左山1號’中ABA含量均為最高且與其他品種具有顯著性差異。10月19日時ABA含量‘左山1號’中比‘101-14’‘3309C’ ‘SO4’和‘黑比諾’分別高4.76%、39.87%、67.35%和187.74%。在10月19日與11月12日ABA含量均表現出‘左山1號’>‘101-14’>‘3309C’>‘SO4’>‘黑比諾’，且各品種間都具有顯著性差異。

表3 5個葡萄品種不同時期ABA、GA3和IAA含量Table 3 Content of ABA,GA3 and IAA content in five grape varieties at different stages

在不同取樣時期GA3含量都表現為‘黑比諾’最高，‘左山1號’最低，且與‘101-14’‘3309C’和‘SO4’具有顯著性差異。‘黑比諾’在8月8日高出其余品種40.52%～91.69%，9月1日高出43.58%～96.93%，9月25日時高出63.41%～95.24%。在10月19日時GA3含量在各品種間均具有顯著性差異且含量表現為‘左山1號’<‘101-14’<‘3309C’<‘SO4’<‘黑比諾’。11月12日時GA3含量在各品種間的差異增大，其中‘黑比諾’分別比‘左山1號’ ‘ 101-14’‘3309C’和‘SO4’高372.50%、200.00%、145.45%和 85.29%。

‘左山1號’中IAA含量在每一個時期都低于其他品種。在8月8日與9月1日時IAA含量在‘SO4’中最高，分別為8.18和7.00 μg/g。9月25日IAA含量在‘黑比諾’中最高，分別比‘左山1號’‘101-14’‘3309C’和‘SO4’高94.53%、43.03%、72.86%和5.22%。在10月19日時‘黑比諾’中IAA含量為6.22 μg/g，顯著高于其他品種。11月12日時‘黑比諾’中IAA含量較10月19日有所增加，此時‘SO4’中IAA含量在5個品種中最大但與‘黑比諾’無顯著性差異，‘左山1號’中IAA含量顯著低于其余4個品種，其中比‘黑比諾’和‘SO4’低55%左右。

如圖1所示，ABA/IAA的值在9月1日之后逐步增加且均表現為‘黑比諾’最低，‘左山1號’最高，且與其他品種具有顯著性差異。

ABA/GA3與ABA/(IAA+GA3)的值在每一個時期均表現為‘黑比諾’顯著低于其他品種，9月1日之后‘左山1號’中的值顯著高于同一時期其他品種。在10月19日與11月12日時，ABA/IAA，ABA/GA3與ABA/(IAA+GA3)的值均表現為‘左山1號’>‘101-14’>‘3309C’>‘SO4’>‘黑比諾’，這與抗寒系數的排列順序完全一致。

2.4 葡萄枝條韌皮部可溶性糖含量與品種抗寒性相關性

在不同時期可溶性糖含量與抗寒系數的相關性有所不同。如表4所示，在10月19日及11月12日時枝條韌皮部中蔗糖含量與抗寒系數呈極顯著正相關，相關系數分別為0.953和0.949。葡萄糖含量與抗寒系數相關性在9月1日之前較低，在9月25日、10月19日與11月12日達極顯著正相關，其中在9月25日時相關系數最高，達到0.980。果糖含量與抗寒系數在8月8日、10月19日及11月12日為顯著正相關，其中在10月19日時相關系數最大，為0.933。10月19日與11月12日時三種可溶性糖含量與抗寒系數都有較強的相關性，與蔗糖和葡萄糖的相關性強于果糖的。

表4 抗寒系數與不同時期蔗糖、果糖、葡萄糖含量的相關系數Table 4 Correlation coefficient of cold resistance coefficient and sucrose,fructose,and glucose content in different periods

2.5 葡萄枝條韌皮部內源激素含量與品種抗寒性相關性

不同時期枝條韌皮部中內源激素的含量與抗寒系數的相關性不同。如表5所示，抗寒系數與ABA、ABA/IAA、ABA/(IAA+GA3)、ABA/GA3含量有較強的正相關，與GA3與IAA含量均有較強的負相關。其中，ABA含量與抗寒性在9月1日和9月25日時為顯著水平，在10月19日與11月12日呈極顯著正相關。IAA含量在9與1日之后均與抗寒系數為顯著相關，相關性在10月19日達到最大，相關系數為-0.913。GA3含量與抗寒系數在9月25日之前為顯著性相關，在10月19日與11月12日相關系數達到-0.989，為極顯著負相關。ABA、IAA及GA3含量與抗寒系數的相關性均在10月19日及11月12日時高于其他時期。ABA/IAA與抗寒系數的相關性在8月8日與9月25日為顯著水平，9月1日、10月19日及11月12日呈極顯著正相關。ABA/GA3與抗寒性的相關性在每個時期均為顯著正相關。ABA/(IAA+GA3) 與抗寒性的相關性在9月25日為顯著相關，其余每個時期均極顯著正相關。

表5 抗寒系數與不同時期內源激素含量及其比值的相關系數Table 5 Correlation coefficient of cold resistance coefficient,endogenous hormone content and its ratio in different periods

3 討論與結論

3.1 葡萄枝條韌皮部可溶性糖含量與抗寒性的關系

可溶性糖在面臨低溫時可通過提高細胞滲透勢來降低細胞結冰溫度，促進脯氨酸的積累來增加膜穩定性，直接作為保護劑來保護原生質體、線粒體及膜上敏感偶聯因子，從而全面提高植物的抗寒性[8]。本研究中，在10月下旬至埋土越冬前葡萄枝條韌皮部中蔗糖、葡萄糖和果糖含量均表現為抗寒性強的品種顯著高于抗寒性較弱的品種。研究發現，梨[24]、大葉女貞[14]、平歐榛[15]等樹種和作物在面臨低溫時，均表現為抗寒性越強的品種可溶性糖含量越高，本試驗研究結果與此相一致。可溶性糖直接或間接的對抗寒性產生了復雜的調節，其中蔗糖作為植物在光合作用過程中的主要產物，在遇到低溫環境時起到了重要作用。王小樂等[25]研究發現，低溫條件下不同菊花品種的離體保存中蔗糖提高了幼苗存活率、保護試管苗的組織結構、增加了綠葉數、增強其恢復生長能力和遺傳穩定性，表明蔗糖有效地提高了植物抗寒性。楊光[26]以不同釀酒葡萄的枝條為試驗材料研究發現蔗糖和葡萄糖比果糖在調控低溫誘導基因表達中發揮的作用更為關鍵。本研究結果顯示在9月25日之后不同可溶性糖含量與抗寒系數的相關性均高于9月1日之前，且在10月19日與11月12日時韌皮部中蔗糖及葡萄糖對葡萄枝條抗寒性的影響大于果糖。表明在枝條生長發育后期韌皮部中可溶性糖含量與抗寒性的相關關系會越密切，且糖含量的增加可以作為提高葡萄抗寒性的機制之一。

3.2 葡萄枝條韌皮部內源激素含量與抗寒性的關系

植物激素是植物面對逆境時的重要信號分子，在受到逆境脅迫時植物會通過增加或降低某種激素或通過調節激素間的比值來應對脅迫[27]。本研究結果表明，自8月8日至11月12日隨著田間自然降溫，葡萄枝條韌皮部中ABA含量與抗寒系數的相關性逐步增強，在10月19日之后不同品種中ABA含量的高低與抗寒性的強弱完全一致。Soitamo等[28]和項洪濤等[29]研究表明，低溫環境下植物體內的ABA含量會明顯增加，不同品種中抗寒性越強ABA含量越高，與本研究結果一致。目前關于IAA、GA3與抗寒性的關系報道的不多并且表現規律不一致，本研究中葡萄枝條韌皮部中的IAA和GA3含量與不同品種抗寒力表現出不同程度的負相關，且隨著枝條生長發育IAA和GA3含量有所降低，與抗寒系數的相關性增強。該研究結果與低溫脅迫冬小麥[30]、薰衣草[16]等試驗中的結果類似。這可能是GA3和IAA通過延緩葉綠素的降解和蛋白質的升高從而減緩生長速率以應對低溫。但是在油棕葉片[31]、百合鱗莖外層[32]中表現出隨著溫度降低IAA含量升高且在抗寒性強的品種中IAA含量較高，本試驗研究結果與此不符，可能是因為作物本身抗寒機制的不同或采樣部位等的不同所引起。激素間的相互平衡對于抗寒性起著復雜的調節作用，曲凌慧等[5]在葡萄葉片中指出 ABA/GA3和ABA/IAA含量高的品種抗寒性強，在較低溫度下小麥[31]、黃瓜[33]根系中高ABA、低GA及高ABA/GA均對抗寒有利。這與本文中提到的在葡萄枝條生長發育后期，高含量的ABA，ABA/GA3、ABA/IAA和ABA/ (IAA+GA3)以及低含量的GA3與IAA均可提高葡萄的抗寒性不盡相同。表明ABA、IAA、GA3含量以及他們的比值均對葡萄抗寒性有一定影響。在枝條生長發育后期提高ABA含量，降低IAA和GA3含量更有利于提高葡萄的抗 寒性。