小麥 BES1轉錄因子全基因組鑒定與分析

盧 晨，李 寒，王書平，2，張迎新，2，尹軍良，2，馬東方，2，方正武，2

(1.長江大學 農(nóng)學院，主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434025；2.西北農(nóng)林科技大學，旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊陵 712100)

植物特異性轉錄因子(BRI1-EMS-Suppressor，BES1)是油菜素內(nèi)酯(Brassinolide，BR)信號途徑中的關鍵轉錄因子，對調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和逆境脅迫具有非常重要的作用。植物經(jīng)常遭受一系列生物和非生物脅迫，導致產(chǎn)量和質(zhì)量下降。轉錄因子通過激活或抑制靶基因的轉錄，從而在植物生長發(fā)育和應激反應調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。BES1是BRs信號通路的重要轉錄因子，通過激活下游基因的轉錄調(diào)控BRs靶基因的表達，最終調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育和抗逆能力[2-4]。油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids,BRs)是一類重要的植物內(nèi)源激素，在提高作物的抗逆性以及調(diào)節(jié)植物衰老等生理功能方面發(fā)揮了重要作用，被國際上譽為第六激素[2]。已有研究結果表明，在BRs信號轉導過程中，轉錄因子的磷酸化、去磷酸化和蛋白激酶的磷酸化是BRs調(diào)控植物生長發(fā)育以及提高作物抗逆性的內(nèi)在生化機制[3]。

擬南芥的BR信號通路中，BES1和BZR1(Brassinazole Resistant 1)在細胞核內(nèi)參與芥子油苷的生物合成[3]。在擬南芥主根維管束原組織中，BES1可以調(diào)節(jié)BR受體BRL3。Salazar等[5]研究發(fā)現(xiàn)，正向調(diào)節(jié)因子BES1在BRI1和BIN2的下游起作用，類固醇受體BRL3處理可以增加BES1基因表達水平和其核積累。相反，BES1蛋白表達受到BIN2激酶的負調(diào)控。基因突變的BES1蛋白在BES1-D中穩(wěn)定且高水平積累[6]。BR信號通路中BES1的作用機理研究對于深入研究植物調(diào)控具有很重要的意義[3]。雖然目前對小麥(TriticumaestivumL.)中大多數(shù)轉錄因子的研究較多，但缺乏對BES1轉錄因子家族的系統(tǒng)研究。為全面解析小麥BES1轉錄因子家族信息，本研究擬通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹、蛋白質(zhì)特征、基因結構、啟動子、染色體分布、轉錄組及同源性分析，為利用小麥BES1基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 普通小麥、烏拉爾圖小麥、野生二粒麥和粗山羊草BES1蛋白序列的檢索與鑒定

烏拉爾圖小麥T.urartu(v1.43)，野生二粒麥T.dicoccoides(v1.0.43)和粗山羊草Ae.tauschii(v4.0.43)基因組數(shù)據(jù)從EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫下載。普通小麥T.aestivum(IWGSC v1.1)來源于小麥研究聯(lián)盟IWGSC(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies)[7]。從HMMER 3.0下載pfam域PF05687(BES1_N)序列；搜集已鑒定的擬南芥中的8個BES1(AtBES1，TAIR10，http://www.arabidopsis.org/index.jsp)[8]，玉米中的11個BES1(ZmBES1，maizeGDB，https://www.maizegdb.org/)[9]和水稻中的6個BES1(OsBES1，RGAP，http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)[10]。以上述獲得的序列作為查詢序列，設置閾值E<10-10，BLASTp(Protein-protein Basic Local Alignment Search Tool)搜索4個小麥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，合并結果并刪除冗余序列。利用Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/search)鑒定并刪除不含有PF05687(BES1_N)結構域的序列，最終確定15個小麥BES1基因家族成員。

1.2 序列比對和系統(tǒng)進化樹的構建

利用ClustalW2[11]將所有BES1基因的氨基酸序列對齊，然后利用MEGA 7.0最大似然法Maximum Likelihood(ML)生成系統(tǒng)發(fā)育樹[12-13]。通過互動生命之樹網(wǎng)站(IToL，version 3.2.317，http://itol.embl.de)繪制并美化系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 TaBES1的染色體定位

從基因組注釋信息GFF3文件中提取包含各基因染色體起始位置信息的TaBES1的基因注釋文件。然后通過MapInspect軟件繪制物理圖譜[14]。

1.4 預測TaBES1蛋白的特性

使用蛋白質(zhì)分析工具ExPASy Server10(SIB Bioinformatics Resource Portal，https://prosite.expasy.org/PS50011)[15]預測TaBES1蛋白質(zhì)長度，分子質(zhì)量(MW)，等電點(pI)，穩(wěn)定性和親水性的均值(GRAVY)等特征。用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽的長度，并通過網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)和Plant-mPLoc(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位預測。

1.5 TaBES1基序(Motifs)、基因結構和啟動子分析

使用MEME(v4.9.1，http://meme-suite.org/index.html)[16]和Smart Motif(http://smart.embl-heidelberg.de/)[17]搜索工具鑒定保守的TaBES1蛋白基序。以已知的AtBES1、OsBES1和ZmBES1蛋白序列為參考序列。TaBES1保守蛋白基序通過以下標準識別：(1)每條序列可以包含位置不重疊的多個基序；(2)最多20個不同的基序；(3)基序長度為6～50 aa。TBtools軟件展示保守基序圖。根據(jù)TaBES1基因組注釋信息，使用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)[18-19]繪制基因(外顯子-內(nèi)含子)結構。為鑒定小麥BES1基因啟動子序列中的順式元件，從小麥數(shù)據(jù)庫(IWGSC v1.1)中提取15個TaBES1基因上游序列1 500 bp，使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)標識啟動子序列中的cis-elements。然后，用R軟件包的“Pheatmap”展示預測結果。

1.6 TaBES1的多條件轉錄組分析

旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室前期從NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫收集小麥多條件轉錄組分析的原始RNA-seq，通過sratoolkit子例程fastq-dump，將獲得的SRA格式數(shù)據(jù)轉換為fastq格式，通過Trimmomatic過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)，通過Trinity(v2.0.6)進行從頭組裝，通過TransDecoder(v5.3.0)進行開放閱讀框預測，最后通過FPKM計算轉錄本表達水平，所有程序均使用默認參數(shù)進行計算。基因表達水平通過片段按每百萬堿基對外顯子每千克堿基數(shù)(FPKM)模型進行歸一化[20]。然后利用R軟件包pheatmap根據(jù)FPKM值繪制熱圖。

1.7 4 種物種同源基因的鑒定

用互相BLASTp(閾值E<10-10，匹配度>80%)鑒定普通小麥，烏拉爾圖小麥，野生二粒麥和粗山羊BES1的同源關系。利用R軟件包“circlize”繪制同源關系圖譜。直系同源的最原始定義為：兩個不同物種中的兩個基因，起源于這兩個物種最后一個共同祖先的同一個基因。旁系同源被定義為：從一個基因組中復制衍生出來的基因[21]。

2 結果與分析

2.1 小麥基因組 BES1的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖1可知，通過25個(8個AtBES1、11個ZmBES1和6個OsBES1)已知BES1蛋白序列，最終確定了15個小麥BES1基因家族成員。pfam(PF05687BES1-N)和具有核心基序(E<10-5)的局部BLASTP進一步證實候選序列，去除沒有BES1特異性蛋白活性區(qū)的序列。最后，利用MEGA 7.0最大似然(ML)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結果表明，BES1可分為四大類(Group a、Group b、Group c、Group d)，TaBES1在Group b中沒有分布。

2.2 TaBES蛋白序列比對和特征分析

使用DNAMAN比對15個TaBES1蛋白序列(圖2)。利用網(wǎng)站W(wǎng)ebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)制作出TaBES1家族高保守區(qū)段BES1_N的比對結果(圖3)。由表1可知TaBES1長度的平均值為312 aa，分布范圍178～359 aa；分子質(zhì)量平均值為33.08 ku；分布范圍19.27～37.86 ku，等電點的平均值為8.66，分布范圍8.13～9.4，為堿性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定指數(shù)平均值為61.62，分布范圍50.78～ 69.99，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(指數(shù)大于40)；脂肪族指數(shù)平均值為55.92，分布范圍48.3～ 71.84；親水性的平均值-0.59，分布范圍-0.751～0.482，基本小于0，說明它們都是親水性蛋白質(zhì)。多網(wǎng)站預測亞細胞定位結果顯示所有的TaBES1蛋白位于細胞 核內(nèi)。

表1 小麥BES1家族的蛋白質(zhì)特征及染色體位置Table 1 Protein characteristics and chromosomal location of wheat BES1 family

2.3 TaBES1 motif與基因結構分析、染色體定位和基因重復事件

外顯子-內(nèi)含子結構顯示：幾乎所有的TaBES1都含有一個內(nèi)含子，大部分TaBES1都在序列兩端具有UTR非編碼區(qū)，僅TaBES1a3兩端不具有UTR，TaBES1d5的5′端不具有UTR區(qū)。用MAST在線軟件查詢TaBES1蛋白序列中的20個保守motif，如圖4所示，小麥BES1家族motif分析(b)和基因結構(c)高度的相似性說明TaBES1家族的高保守性。

由圖5可知，15個TaBES1基因均勻地、相似度極高地分布在小麥A、B和D染色體上。TaBES1c2、TaBES1c3和TaBES1c1基因為三聯(lián)體，分別分布在2A、2B和2D染色體的相似位置[21]。TaBES1a3、TaBES1a2和TaBES1a1為三聯(lián)體，分布在3A、3B和3D染色體相似位置。TaBES1d3、TaBES1d2和TaBES1d1為三聯(lián)體，TaBES1d4、TaBES1d5和TaBES1d6為三聯(lián)體，TaBES1d9、TaBES1d7和TaBES1d8為三聯(lián)體。

在小麥BES1基因家族中共找到13組基因重復，TaBES1a2與TaBES1a1、TaBES1a3與TaBES1a1、TaBES1a3與TaBES1a2、TaBES1c3與TaBES1c1、TaBES1c2與TaBES1c1、TaBES1c3與TaBES1c2、TaBES1d2與TaBES1d1、TaBES1d3與TaBES1d1、TaBES1d3與TaBES1d2、TaBES1d6與TaBES1d4、TaBES1d8與TaBES1d7、TaBES1d9與TaBES1d7、TaBES1d9與TaBES1d8(圖5)，這13組基因復制都是片段重復，在小麥BES1基因家族中未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復。

2.4 TaBES1的轉錄組學分析

從NCBI網(wǎng)站下載并整理的轉錄組數(shù)據(jù)分為三類，包括生長發(fā)育(圖6)、非生物脅迫(圖7)和生物脅迫(圖8)。由圖6可知，TaBES1a1、TaBES1a2、TaBES1a3、TaBES1d4、TaBES1d5和TaBES1d6基本不表達，所以其功能可能與生長發(fā)育無關。TaBES1d3、TaBES1d2和TaBES1d1基因在苗期、三葉期、分蘗期、孕穗期、抽穗期、開花期、結實期都有較高的表達量，推測其功能可能與生長發(fā)育有關。TaBES1c1、TaBES1c2、TaBES1c3、TaBES1d7、TaBES1d8和TaBES1d9在胚根苗期、葉鞘根頂端三葉期、根分蘗期、穎片孕穗期、抽穗期和根秧苗期高度表達，推測其功能可能與根和葉鞘的生長發(fā)育有關，具體功能有待進一步驗證。

由圖7可知，TaBES1d3、TaBES1d2和TaBES1d1基因在聚乙二醇6000、干旱、高溫、寒冷脅迫下都有較好的表達，其功能可能與小麥抗逆有關。這一推論與已報道的其他物種BES1家族符合。TaBES1a1、TaBES1a2、TaBES1a3、TaBES1d4、TaBES1d5和TaBES1d6基本不表達，推測其功能可能與抗逆無關。TaBES1c1、TaBES1c2、TaBES1c3、TaBES1d7、TaBES1d8和TaBES1d9在中國春磷、饑餓處理下表達良好。

由圖8可知，TaBES1a1、TaBES1a2、TaBES1a3、TaBES1d4、TaBES1d5和TaBES1d6基本不表達，推測其功能可能與抗病無關。TaBES1c1、TaBES1c2、TaBES1c3、TaBES1d1、TaBES1d2和TaBES1d3在條銹病、白粉病和禾谷鐮刀菌的處理下與對照相比有明顯的差異，其功能可能與抗病有關。條銹病病原菌CYR31處理小麥葉片 24 h～7 d后TaBES1d1和TaBES1d3高度表達，推測其功能可能與條銹相關。

2.5 TaBES1基因啟動子順式元件的研究

由圖9可知，12個、11個和7個調(diào)控因子分別參與生物/非生物脅迫、生長發(fā)育和激素反應。分布最廣的順式元件是脫落酸反應順式作用元件ABRE，核心啟動子元件TATA box和CAAT box都是生長發(fā)育相關的元件。其次最常見的順式元件是茉莉酸甲酯反應元件(CGTCA motif和TGACG motif)，幾乎分布在所有基因中 (93.3%)，另外，光響應元件(g-box，85%)分布也較為廣泛。

小麥BES1啟動子分析發(fā)現(xiàn)，與生長發(fā)育有關相關的11個元件中，有3個與啟動子啟動相關的元件(TATA-box、TCA和CAAT-box)，3個順式作用調(diào)節(jié)相關的元件(A-box、box S和TCCC-motif)，2個與生長素相關元件(W box和WRE3)，2個元件與脫落酸相關元件(ABRE和AC-I)，最后一個元件CCGTCC motif為分生組織表達相關的順式作用調(diào)控元件。與生物/非生物脅迫相關的12個元件中，其中4個元件與光響應有關(G-Box、GC-motif、STRE和TCT-motif)，3個參與低溫反應的順式元件(MBS、MRE和MYB)，3個缺氧特異誘導的增強子元件(GT1-motif、I-box和LTR)，2個厭氧誘導所必需的順式作用調(diào)控元件(ARE和as-1)。與激素反應相關的7個元件中，其中5個都為茉莉酸甲酯反應元件(CGTCA-motif、chs、CTAG-motif、DRE core、TGACG-motif和TGA-element)，1個與水楊酸反應相關元件Sp1。

小麥BES1啟動子區(qū)域一共含有838 個順式元件，471(56.2%)個與生長發(fā)育有關，201(24%)個與非生物/生物脅迫有關，166(19.8%)個與激素反應有關。

2.6 普通小麥、烏拉爾圖小麥、野生二粒麥和粗山羊草中 TaBES1基因的同源性分析

經(jīng)鑒定，普通小麥、烏拉爾圖小麥、野生二粒麥和粗山羊草中分別包含15、13、39和13個TaBES1基因(圖10-a)。BES1蛋白可分為3大類(Group a、Group c和Group d)，普通小麥(3、3和9)，烏拉爾圖小麥(8、3和2)，野生二粒麥(8、9和22)，粗山羊草(6、2和5)。如圖10-b所示，共鑒定出90對同源基因。與普通小麥相關的同源物共52對，其中有13對旁系同源物，普通小麥與烏拉爾圖小麥，野生二粒麥和粗山羊草分別有9、18和12對直系同源物。與烏拉爾圖小麥相關的同源物共18對，沒有旁系同源物，烏拉爾圖小麥與普通小麥，野生二粒麥和粗山羊草分別有9、6和3對直系同源物。與野生二粒麥相關的同源物共52對，有21對旁系同源物，野生二粒麥與普通小麥，烏拉爾圖小麥和粗山羊草分別有18、6和8對直系同源物。與粗山羊草相關的同源物共12對，沒有旁系同源物，粗山羊草與普通小麥，烏拉爾圖小麥和野生二粒麥分別有12、3和8對直系同源物。

3 討 論

目前，在149種植物種中發(fā)現(xiàn)BES1轉錄因子，其數(shù)目有2～42個不等，其已有30個轉錄因子被深入研究[22]。吳鵬等[23]在中國白菜中鑒定了15個BES1基因，發(fā)現(xiàn)BES1基因只存在于陸生植物中，且高等植物一般比低等植物的轉錄因子要多，這也表明BES1轉錄因子在植物的進化過程中可能起重要作用。本研究利用生物信息學的方法對小麥BES1轉錄因子家族進行全面的研究，共獲得的15個TaBES1基因與搜集到的8個AtBES1、11個ZmBES1和6個OsBES1共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹，TaBES1成員分為Group a、Group c和Group d三組(圖1)。

通過DNAMAN比對獲得的15個TaBES1蛋白序列(圖2)，顯示所有TaBES1蛋白都含有BES1_N結構域。外顯子-內(nèi)含子結構顯示TaBES1a3兩端不具有UTR，TaBES1d5的5′端不具有UTR區(qū)，TaBES1a3和TaBES1d5在后續(xù)的轉錄組分析中基本都不表達，據(jù)此推測缺失UTR可能導致TaBES1不表達。接下來的研究發(fā)現(xiàn)，小麥BES1基因家族中共找到13組基因重復和同源分析13對旁系同源物數(shù)量一致。

關于TaBES1基因的表達模式，不同組的基因表達水平有顯著差異。在生長發(fā)育、生物/非生物脅迫條件下TaBES1a1、TaBES1a2、TaBES1a3、TaBES1d4、TaBES1d5和TaBES1d6，基本不表達，推測其功能可能與生長發(fā)育和非生物脅迫無關。TaBES1c1、TaBES1c2和TaBES1c3基因的表達水平在生物脅迫下表達較好，推測其功能可能與脅迫有關。TaBES1d3、TaBES1d2和TaBES1d1在生長發(fā)育、非生物脅迫和生物脅迫下都高度表達，推測其功能與生長發(fā)育、生物/非生物脅迫相關。

異源六倍體小麥是一種古老的多倍體植物，至少經(jīng)歷兩輪全基因組復制(WGD)事件，這導致小麥基因組包含超過85%的重復基因[24]。重復基因的存在可以通過新功能化，亞功能化和非功能化為基因進化提供更多機會[25]。因此，有必要檢測TaBES1的基因重復，進而初步分析出其進化關系。普通小麥相關的同源物性共52對，有13對旁系同源物(25%)與小麥LSD基因家族中13組基因重復數(shù)量一致。小麥與烏拉爾圖小麥、野生二粒麥和粗山羊草的直系同源物分別有9對(13%)、18對(35%)和12對(32%)，共39對(75%)。由此推測，根普通小麥BES1基因的進化關系如下，小部分(13對，25%)來源于自身的進化，大部分(39對 75%)來源于3種亞基因組 供體。