運輸應激對馬體溫、血液指標及HP、TNF-α、IFN-γ mRNA表達水平的影響

莫麗得爾·賽明，買占海，孫亞偉，屈 瑞，劉 彬，葉夢珺，王金泉

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院,烏魯木齊 830052；2.昌吉良源農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司,新疆昌吉 831100)

中國是馬匹資源大國，開展馬疾病防治和健康養(yǎng)殖等方面的科學研究對馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。新疆是中國主要的養(yǎng)馬省區(qū)之一，全疆馬存欄87.5萬匹[1]，居全國首位。馬匹運輸?shù)脑蚨喾N多樣，如表演、比賽、屠宰、繁殖等，隨著社會的發(fā)展，馬匹運輸越來越常態(tài)化。運輸應激指在運輸過程中的禁食禁水、環(huán)境變化(濕度、溫度、密度)、顛簸等應激源刺激下，動物自身產(chǎn)生的一種適應性和防御性反應，是影響動物生產(chǎn)性能、繁殖性能、內(nèi)分泌代謝和機體免疫力的重要因素之一[2]。運輸應激與急性期蛋白的變化有著緊密的聯(lián)系，在馬疾病診療以及健康福利評價中，最常檢測的急性期蛋白是觸珠蛋白(Hapboglobin，HP)，HP是機體發(fā)生急性期反應時濃度值增加的正向急性期蛋白，有研究顯示，15匹馬進行4 h短途運輸，運輸后馬血液中HP明顯升高[3]。應激可導致細胞因子的產(chǎn)生，有研究表明，應激可以改變免疫細胞的功能，促進炎癥細胞聚集,進而激活免疫應答，發(fā)生炎癥反應[4-5]。本研究以漢諾威雜交F1代馬為研究對象，讓其進行15 h的運輸，測定馬匹體溫和血常規(guī)指標，并采用RT-qPCR方法檢測外周血淋巴細胞中HP以及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ) mRNA的表達量，研究運輸應激對馬匹的影響，探討運輸應激與以上指標的關系，篩選運輸應激相關生物診斷標志物，為應激的預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑與儀器 馬外周血淋巴細胞分離液(Solarbio)、Trizol(貨號：15596026，Thermo Fisher)、氯仿；無水乙醇；異丙醇；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara)、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)Cat # RR820A(Takara)；ABI 7500 Fast Real-Time PCR System；深圳市普康電子有限公司PE-6800型全自動血細胞分析儀。

1.1.2 試驗動物 從新疆塔城裕民縣馬繁育基地選擇4匹12月齡、體質量相近的漢諾威雜交F1代健康馬匹，運輸前，將馬匹喂草減半喂水給足后裝載至箱式馬車，21：07從塔城裕民縣出發(fā)，運輸途中喂水 1 次，次日11：45到達新疆昌吉硫磺溝馬繁育基地，到達后馬匹正常飼喂。運輸全程約787 km，道路包括山路、鄉(xiāng)間小路、砂石路以及高速公路，車廂內(nèi)最高溫度23.4 ℃，最低溫度12.5 ℃，最高濕度56%，最低濕度29%，運輸時長15 h。

1.2 方 法

1.2.1 體溫和血常規(guī)測定 分別對4匹漢諾威雜交F1代馬在運輸前1 h、運輸中7 h、運輸后1 h和9 h用紅外額溫計測量體溫以及頸靜脈采血，用深圳市普康電子有限公司PE-6800型全自動血細胞分析儀測定白細胞總數(shù)(WBC)、淋巴細胞比率(LYM)、淋巴細胞(LYM)、中間細胞(MID)、粒細胞(GRAN)、紅細胞總數(shù)(RBC)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞分布寬度SD(RDW-SD)、紅細胞分布寬度CV(RDW-CV)、血小板總數(shù)(PLT)、血小板平均體積(MPV)、血小板壓積(PCT)等血常規(guī)指標，試劑購自深圳市普康電子有限公司。

1.2.2 馬外周血淋巴細胞的分離 取2.5 mL新鮮抗凝全血用2.5 mL全血及組織稀釋液稀釋，緩慢疊加到裝有馬外周淋巴細胞分離液的離心管中，保持兩液面界限清晰，室溫下3 000 r/min離心25 min，離心管底部是紅細胞與粒細胞。小心吸取血漿與分離液之間的淋巴細胞層至15 mL無酶離心管中，加入10 mL細胞洗滌液洗滌淋巴細胞，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，用5 mL PBS重懸細胞后再1 000 r/min離心10 min，棄上清，淋巴細胞置于-80 ℃保存，備用。

1.2.3 馬外周血淋巴細胞總RNA提取 取凍存淋巴細胞，使用微型旋渦混合儀熔化，加入600 μL Trizol，劇烈振蕩混勻，取2 mL混合液加入無酶離心管中，振蕩，室溫靜置5 min。加入200 μL氯仿，振蕩(避免劇烈振蕩，防止RNA斷裂)，充分乳化后，室溫靜置5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。取上層水相750 μL至新的無酶離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃靜置30 min。4 ℃12 000 r/min 離心15 min。棄上清，勿將沉淀倒掉，沉淀先用體積分數(shù)為100%的無水乙醇洗滌(盡可能彈起沉淀，漂浮30 s。)棄上清，切勿將沉淀倒掉，沉淀再用體積分數(shù)為75%的無水乙醇洗滌，4 ℃ 10 000 r/min 離心10 min，吸凈上清后靜置，待乙醇揮發(fā)晾干后加入10 μL無酶水冰上溶解1 h，取2 μL RNA樣品用Nanodrop分光光度儀檢測RNA的質量濃度及純度，依照Takara反轉錄試劑盒說明書反轉錄成cDNA，-80 ℃保存，備用。

1.2.4HP、TNF-α、IFN-γ、GAPDH基因引物信息 擴增馬HP、TNF-α、IFN-γ、GAPDH基因片段的引物序列如表1所示[6-8]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 HP、TNF-α、IFN-γ 和GAPDH基因引物信息Table 1 Primer information of HP,TNF-α,IFN-γ and GAPDH genes

1.2.5 馬外周血淋巴細胞中HP、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達水平檢測 采用RT-qPCR方法檢測淋巴細胞中HP、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達水平，具體操作步驟參照用戶手冊，反應體系見表2。

表2 實時定量熒光PCR反應體系Table 2 Reaction system of real-time quantitative PCR

反應條件：預變性95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃34 s，40個循環(huán)；95 ℃15 s，64 ℃1 min，95 ℃ 15 s。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用2-△△Ct法進行相對定量分析，用GraphPad Prism 8.0、SPSS 17.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理和繪圖，數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，組間差異比較采用One-Way ANOVA分析，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01、P<0.001為差異極其顯著。

2 結果與分析

2.1 馬匹體溫測定

如表3所示，運輸后馬體溫呈上升趨勢，運輸中7 h的體溫顯著高于運輸前1 h(P<0.05)，運輸后1 h的體溫極顯著高于運輸前1 h(P<0.01)，運輸后9 h 體溫下降，但仍顯著高于運輸前(P<0.05)。

表3 馬運輸前后的體溫Table 3 Body temperature before and after horse transport

2.2 血常規(guī)指標測定

如表4所示，運輸后9 h，MCV水平較運輸前1 h顯著降低(P<0.05)，LYM、MPV、PLT、HCT較運輸前1 h降低，但差異不顯著(P>0.05)，MID、RDW-SD、RDW-CV較運輸前1 h上升，但差異不顯著(P>0.05)，其中，HCT一直呈下降趨勢，其他指標運輸后9 h有恢復趨勢。

表4 馬運輸前后的血常規(guī)指標Table 4 Blood indexes before and after horse transport

2.3 目的基因的擴增曲線與溶解曲線

采用RT-qPCR方法檢測各目的基因的轉錄水平，對目的基因的擴增曲線、熔解曲線觀察發(fā)現(xiàn)，各目的基因的擴增曲線均為標準的“S”形 (圖1)，且間距均勻。熔解曲線均為特異的單峰(圖2)，且起峰時間一致，表明引物特異性較好，產(chǎn)物純度高，沒有受到污染，定量結果相對穩(wěn)定，結果可信。

2.4 馬外周血淋巴細胞中HP、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達水平

經(jīng)15 h運輸后，用RT-qPCR方法檢測運輸前1 h、運輸中7 h及運輸后1 h和9 h馬外周血淋巴細胞中HP、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達量，如圖3所示，HP的mRNA表達量呈上升趨勢，在運輸后1 h達到高峰，運輸后9 h逐漸恢復，與運輸前1 h對比，運輸后1 hHP的mRNA表達量極顯著升高(P<0.001)；TNF-α的mRNA表達量一直呈上升趨勢，與運輸前1 h對比，運輸后9 hTNF-α的mRNA表達量極顯著升高(P<0.001)；IFN-γ的mRNA表達量呈上升趨勢，在運輸后1 h達到高峰，運輸后9 h逐漸恢復，與運輸前1 h對比，運輸后1 h淋巴細胞中IFN-γ的mRNA表達量極顯著升高(P<0.001)。

3 討 論

3.1 運輸應激對體溫的影響

體溫是衡量應激反應的常用指標，吳榮華等[9]研究發(fā)現(xiàn)，運輸后西門塔爾牛的體溫較運輸前顯著升高(P<0.05)，體溫升高的可能機理是運輸過程中應激源的作用，引起動物精神高度緊張，機體激素分泌增多，使得能量代謝增強，產(chǎn)熱量增加，導致體溫上升。本研究結果顯示，運輸后1 h較運輸前1 h體溫顯著升高，運輸后9 h逐漸恢復，與吳榮華等[9]的研究結果相似。

3.2 運輸應激對血常規(guī)指標的影響

機體體內(nèi)代謝是一個穩(wěn)態(tài)過程，檢測血液中一些指標的變化能夠更好地解釋疾病的發(fā)生轉歸過程，從而達到預防、治療疾病的目的[10]，血常規(guī)檢查是指通過觀察白細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等各項指標的變化，檢測動物機體健康程度及有無異常現(xiàn)象，運輸過程中也會造成動物機體血常規(guī)指標發(fā)生變化[11-12]。余傳辛[13]對新西蘭兔進行公路運輸，MCV在運輸后極顯著降低(P<0.01)；高秀秀[14]對小型豬進行公路運輸，MCV在運輸后顯著降低(P<0.05)。本研究結果顯示，運輸后9 h MCV水平較運輸前1 h顯著降低(P<0.05)，與余傳辛[13]、高秀秀[14]的研究結果相似。高維平等[15]對德州驢進行長途運輸，LYM較運輸前顯著降低(P<0.05)；梁旺等[16]對比格犬進行短途運輸，HCT較運輸前有下降趨勢；Padalino等[17]對16匹馬進行長途運輸，PLT較運輸前有下降趨勢。在本研究中，LYM、PLT、HCT等指標無顯著差異但與高維平等[15]、梁旺等[16]、Padalino等[17]的研究結果相似。

3.3 運輸應激對HP、TNF-α、IFN-γmRNA表達的影響

有機體在應激過程中，細胞因子和急性期蛋白均會產(chǎn)生不同程度的變化，因此兩者常被用于動物的健康福利評價及疾病的診療中。但急性期蛋白的半衰期明顯比細胞因子更長，一般在應激發(fā)生幾小時到24 h濃度會發(fā)生顯著變化，并在 48 h內(nèi)維持較高水平[18]，同時還具有更高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，因此應用更為廣泛，已被作為許多疾病和應激狀態(tài)下機體內(nèi)的分子生物學標志物使用[19-23]。

HP是一種由肝臟合成，廣泛分布于哺乳動物血清和體液中的α2球蛋白，可以與血紅蛋白結合形成復合物，降低與溶血相關的氧化損傷。此外，HP在參與宿主抗感染、損傷組織修復以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，在馬匹發(fā)生炎癥反應后含量會上升1～10倍[24]。袁建彬等[25]選用肉牛進行6 h的運輸應激試驗，研究結果顯示與運輸 0 h組相比，在運輸應激3 h后，肝臟組織中HP的mRNA表達量顯著升高。許利凡[26]選用8月齡雄性健康的夏南牛進行20 h的長途運輸應激試驗，研究結果顯示，牛外周血淋巴細胞中HP的mRNA表達量在運輸6 h時達到高峰，其中運輸中6 h、10 h的表達量與運輸前1 h相比均差異極其顯著(P<0.01)。本研究結果顯示，運輸應激會引起馬外周血淋巴細胞中HP的mRNA表達量升高，與袁建彬等[25]、許利凡[26]的研究結果 相似。

細胞因子是機體多種細胞分泌的，具有多種生物學效應的小分子多肽物質，是神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡中的重要遞質，參與和調節(jié)機體的生理功能，傳遞細胞網(wǎng)絡間的生物信息等[27]，細胞因子對調節(jié)免疫和炎癥反應起著重要的作用[28]。王自力等[29]對30只大鼠進行運輸應激模擬試驗，研究結果顯示，模型組大鼠肺臟組織中TNF-α和IFN-γ的mRNA表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。有研究表明，運輸應激可造成豬胸膜肺炎、肉牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合征等疾病[30-32]，可誘導運輸后閹牛血液TNF-a含量的急劇升高[33]。環(huán)境改變會引起動物機體不適，應激源的免疫挑戰(zhàn)會導致TNF-α、IFN-γ等細胞因子從組織中釋放[34]。有研究表明，熱應激和冷應激也會導致動物機體內(nèi)TNF-α和IFN-γ的mRNA表達量升高(P<0.05)[35-36]。本研究中，對年齡和體質量相近的健康馬匹長途運輸15 h，結果顯示，運輸應激引起馬外周血淋巴細胞中TNF-α和IFN-γ的mRNA表達量升高，會誘發(fā)動物機體炎癥反應，與王自力等[29]的研究結果 相似。