魚類致病嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5的原核表達、免疫保護及抗血漿殺菌作用研究

榮 娜，簡思杰，孫 薇，康 超，伍娜娜，劉 祥

(陜西理工大學 生物科學與工程學院，中德天然產物研究所，陜西漢中 723001)

嗜水氣單胞菌 (Aeromonashydrophila)屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一種在水生環境中廣泛存在的條件致病菌，可誘發水生動物局部出血和敗血癥，給水產養殖業帶來巨大的收入損失[1-2]。對于該菌的防治，傳統上主要采用抗生素藥物，但長期使用會導致菌株抗藥、機體抗生素殘留和水體污染等問題[3]。疫苗免疫安全性高、無毒害，但目前普遍應用于水產養殖的滅活疫苗存在免疫效果欠佳和二次感染的風險[4-5]，因此有必要研制有效防治嗜水氣單胞菌的新型疫苗。亞單位疫苗是一種以純化的蛋白、核酸或多糖等免疫活性片段作為組分的新型疫苗，具有安全穩定且免疫持久等優點[6-7]，受到廣泛關注。

外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)是細菌外膜的主要構成部分，在維持細菌結構完整性和物質轉運等方面有著重要作用[8-9]。此外，外膜蛋白具有高度的免疫原性，是一種潛在的保護性抗原[10]。P5蛋白是革蘭氏陰性細菌的一個主要外膜蛋白，也是OmpA蛋白的超家族成員，參與了細菌在體內的定植[11]。有研究表明，P5蛋白免疫原性較強，可激發機體體液免疫產生保護性抗體，是參與機體免疫應答的早期抗原[12]。謝樂新等[13]將副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5分段表達，發現表達的3個蛋白均表現出良好的免疫原性和抗原性。王海峰等[14]研究顯示，P5免疫動物后能誘導產生高水平特異性抗體，并可顯著保護豚鼠抵抗副豬嗜血桿菌感染。P5也是嗜水氣單胞菌的主要外膜蛋白，然而關于該蛋白的免疫功能研究尚未見報道。

基于以上現狀，本研究選取嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白P5為研究對象，原核表達純化P5蛋白并確定其最佳誘導表達條件；將純化的P5蛋白免疫小鼠制備P5多克隆抗血清，探究P5抗血清對紅鯽魚的免疫保護效果；體外評價P5蛋白抵抗魚血漿殺菌的作用，結合P5蛋白的生物信息學分析，以期為嗜水氣單胞菌蛋白亞單位疫苗的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株及供試動物 嗜水氣單胞菌ATCC 7966、Escherichiacoli(E.coli) DH5α、BL21菌株及pET-32a質粒由陜西理工大學中德天然產物研究所保存；4～5周齡昆明鼠購自西安交通大學醫學部，試驗前飼養3 d，每日定量喂食供水；紅鯽魚購自漢中水產市場，外表健康無病，平均體質量約30 g，身長15 cm左右，試驗前于養殖水箱飼養1周，每3 d換水1次，每次換掉1/3，養魚用水經除氯氣處理，水溫控制為(27±1) ℃，每天早晚按照體質量1%投喂鯽魚專用魚糧(廈門華普水產有限公司)，24 h供氧。1周后紅鯽魚呈健康狀態，未出現任何感染癥狀。

1.1.2 主要試劑 rTaq聚合酶、T4-DNA連接酶、內切酶EcoR Ⅰ 和HindⅢ購自TaKaRa公司；細菌基因組提取、質粒提取試劑盒購自上海生工公司；IPTG、TMB顯色液為西安赫特生物科技有限公司產品；HRP標記山羊抗小鼠IgG購于Sigma公司；引物合成、基因測序由天潤奧科生物公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 生物信息學分析 從NCBI數據庫獲取不同血清型嗜水氣單胞菌和不同種類氣單胞菌的P5蛋白序列：嗜水氣單胞菌ATCC 7966(GenBank：ABK37458.1)、GYK1(ABK37458.1)和ML09-119(AGM45792.1)，達氏氣單胞菌(登錄號：WP_026142030.1)，獸生氣單胞菌(WP_043554548.1)，鮭魚氣單胞菌(WP_099994858.1)，豚鼠氣單胞菌(WP_109111770.1)，沙氏氣單胞菌(WP_131731585.1)。通過GeneDoc軟件繪制多重序列比對圖，利用MEGA軟件構建系統發育樹；采用ProParam數據庫預測P5的氨基酸數、分子質量大小、等電點、穩定指數等參數，并從ProScale analysis數據庫中獲取親水性圖譜；采用TMHMM 2.0和Signal P 3.0軟件預測P5的跨膜區域和信號肽位置，并利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件分別進行二級結構和三維結構預測。最后使用STRING軟件在線構建P5與其他蛋白的相互作用關系網絡。

1.2.2 重組菌株的構建 根據NCBI數據庫中嗜水氣單胞菌ATCC 7966全基因組序列(Ge-nBank:CP000462.1)，設計引物擴增P5基因。F-P5:CAAGAATTCATGAATAAAACACTG ATT;R-P5:CATAAGCTTTCACTGCTGA-ACTTCCGA(劃線部分分別為EcoR Ⅰ和HindⅢ的酶切位點)。以全基因組為模板，利用rTaq聚合酶實現P5基因擴增，反應體系為50 μL，退火溫度設為55 ℃。擴增產物經核酸電泳鑒定并回收，EcoR Ⅰ和HindⅢ同時雙酶切PCR產物與載體pET-32a，在T4-DNA連接酶作用下將P5基因導入質粒pET-32a，轉化E.coliDH5a中，獲得重組質粒。雙酶切和基因測序進一步驗證重組質粒，將構建成功的重組質粒轉化至E.coliBL21中，構建P5原核表達菌株。

1.2.3 重組蛋白的誘導表達及純化 挑取P5表達菌的單菌落過夜培養，以1∶100轉接培養至OD600為0.6，加入0.1 mol/L的IPTG，搖床誘導6 h，取1 mL菌液收集菌體，加入300 μL 2×SDS吹打混勻，高溫變性蛋白5 min，離心取上清10 μL進行SDS-PAGE電泳，檢測P5的表達情況，結合包涵體洗滌和SDS-PAGE蛋白電泳，切膠法純化P5蛋白[15]。

1.2.4 重組蛋白表達條件的優化 以L9(34)模型(表1)進行P5的最佳誘導表達條件研究。簡要過程為：以1∶100將過夜培養的P5飽和菌液轉接至600 mL培養液中，37 ℃、200 r/min培養至設定的不同OD600值，按照不同試驗組合要求加入不同終濃度的IPTG，并在規定條件下誘導，每個組合進行3組重復。收取1 mL誘導菌液，沉淀加入300 μL 2×SDS，高溫變性蛋白5 min，樣品通過SDS-PAGE電泳獲得不同誘導條件下P5蛋白的表達圖譜。使用軟件Phoretix 1D和SPSS 13.0分別進行表達圖譜光密度和不同因子的顯著性分析。

表1 P5表達條件試驗的因子與水平Table 1 Factors and levels of P5 expression condition test

1.2.5 蛋白小鼠抗血清的制備及特異性檢測 昆明鼠試驗組和對照組各15只，試驗組每只取純化的P5蛋白100 μg混合100 μL弗氏完全佐劑，腹腔注射免疫小鼠。14 d后，等量蛋白混合100 μL弗氏不完全佐劑，二次免疫小鼠。7 d后，同二免，進行第三次免疫，對照組免疫PBS。1周后眼球取血，靜置，待血清自然析出后于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集抗血清于-80 ℃保存，備用。Western blotting驗證P5抗血清特異性，步驟簡述如下：SDS-PAGE電泳嗜水氣單胞菌全蛋白，恒壓80 V轉NC膜1 h，NC膜充分封閉 2 h，然后與不同稀釋倍數(1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200)的P5抗血清于37 ℃輕搖孵育40 min，對照為陰性抗血清。用TNT緩沖液沖洗3次，再與1∶3 000倍稀釋的二抗于37 ℃輕搖孵育1 h，洗滌后通過DAB顯色法確定P5抗血清的特異性。

1.2.6 體外模擬蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的相互作用 ELISA[16]檢測蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的相互作用：培養嗜水氣單胞菌至OD600約1.0，菌體用φ=1%的甲醛生理鹽水80 ℃滅活，生理鹽水調整菌液OD600=0.2，分裝為1 mL/管(菌量108CFU)，小管菌分別與100 μL不同稀釋倍數的蛋白抗血清(1∶400,1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400)孵育90 min，對照為陰性血清，再與200 μL 1∶3 000倍稀釋的二抗孵育1 h，洗滌菌體并混合20 μL PBS至酶標板中，加入200 μL TMB顯色液，避光顯色10 min，加入終止液2 mol/L H2SO450 μL，450 nm讀數。

1.2.7 抗血清的被動免疫保護試驗 紅鯽魚試驗組和對照組各15尾，試驗前已飼養1周，確定未感染嗜水氣單胞菌。取嗜水氣單胞菌甘油菌接種至600 mL的LB培養基中，28 ℃培養至OD600為1.0，菌體經生理鹽水洗滌并調整OD600至1.0(菌濃度109CFU/mL)。依據抗血清效價，取P5抗血清腹腔注射15尾紅鯽魚，每尾60 μL(對照注射生理鹽水)，2 h后，以嗜水氣單胞菌對紅鯽魚的半數致死量(4×109CFU)感染試驗魚，觀察并記錄試驗魚的病變及死亡情況，當死亡數穩定時，統計試驗組與對照組受試魚的死亡率，并計算免疫保護率(RPS)。RPS=1-(試驗組死亡率/對照組死亡率)×100%[15]。

1.2.8 蛋白抵抗魚血漿的殺菌作用 28 ℃過夜培養嗜水氣單胞菌，以1∶100轉接至100 mL新的培養液中，培養至OD600為0.5，菌體用φ= 0.85%的生理鹽水洗滌并調整OD600為1.0，收取7管1 mL菌液離心獲取菌體，小管菌分別與600 μL不同稀釋倍數的魚血漿(未稀釋血漿，1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32)于28 ℃、200 r/min孵育5 h，對照為生理鹽水。孵育后菌體用生理鹽水洗滌3次，SDS-PAGE分離全蛋白并轉NC膜，NC膜充分封閉后依次與一抗、二抗孵育，通過DAB顯色液進行顯色。對比特異性條帶的亮度，分析P5的差異表達以評價其抵抗魚血漿的殺菌作用。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析

2.1.1 P5同源性與系統發育分析 通過GeneDoc軟件繪制不同菌株P5蛋白氨基酸序列比對圖(圖1)，結果顯示，不同血清型的嗜水氣單胞菌以及氣單胞菌屬間的P5蛋白同源性均較好。利用MEGA軟件構建系統發育樹(圖2)，發現3種不同血清型嗜水氣單胞菌的親緣關系最為緊密，且不同氣單胞菌間親緣關系也較近。因此推測，P5蛋白免疫動物產生的抗體可能為不同種類的氣單胞菌提供交叉免疫保護作用。

2.1.2 P5理化性質、結構與蛋白互作預測 ProtParam數據庫分析顯示：P5含有351個氨基酸，分子質量為36 830.20 u，等電點為4.65，半衰期大于10 h，不穩定指數為25.68，歸類為穩定蛋白；親水性圖譜分析得出P5親水性平均值為-0.178，屬于親水性蛋白(圖3-A)；跨膜結構預測圖譜(圖3-B)顯示，全序列中預測到的跨膜區域可信度較低，該蛋白屬于外膜蛋白；信號肽預測結果(圖3-C)顯示，P5的N端1～21位氨基酸組成了信號肽序列，21～22位氨基酸之間存在切割位點，可信度達0.967 7；SOPMA軟件的二級結構預測顯示，α-螺旋占全序列24.1%，延伸鏈占 23.6%，無規則卷曲占52.3%(圖3-D)；SWISS-MODEL軟件的預測結果顯示，P5的三維結構為桶狀(圖3-E)；通過STRING數據庫構建蛋白互作網絡，發現有10種蛋白可與P5相互作用，其中蛋白rpsL和rplD與P5作用關系最為緊密(圖3-F)。

2.2 P5重組質粒的構建及蛋白表達純化

利用引物F-P5、R-P5擴增P5基因，電泳顯示在約1 000 bp處存在單一條帶(圖4-A)，大小與理論值1 059 bp相符。重組質粒pET-32a-P5經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，得到一條約1 000 bp的條帶，大小符合預期(圖4-B)。目的基因經測序比對，顯示與 NCBI 數據庫所公布的P5基因序列一致，表明成功構建重組質粒。重組質粒轉化至E.coliBL21獲得P5表達菌，經IPTG誘導后，電泳顯示目標蛋白成功表達，分子質量大小約59 ku；利用包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠法純化獲得P5蛋白(圖4-C)。

2.3 P5蛋白表達條件的優化

誘導菌經SDS-PAGE電泳獲得不同誘導條件下P5的表達圖譜(圖5)，圖譜光密度值如表2所示，所得數據極差和方差分析如表3和表4所示。從表3可得出，在誘導P5菌株表達時，最佳條件組合為A3B3C2D2，即在菌液OD600為1.0時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，32 ℃誘導8 h。表4分析結果顯示，加誘導劑時菌液OD600值達到顯著性，由此可得誘導時菌液濃度對于P5蛋白的高效表達尤為重要。

表4 P5表達圖譜光密度數值的方差分析Table 4 Variance analysis of optical density of P5 expression map

表2 P5蛋白表達圖譜光密度分析Table 2 Opticaldensity analysis of P5 expression map

表3 P5表達圖譜光密度數值的極差分析Table 3 Range analysis of optical density of P5 expression map

2.4 P5蛋白抗血清的特異性與效價檢測

Western blotting結果顯示P5抗血清與P5蛋白特異性結合，呈現出明顯的單一條帶，陰性對照無條帶，表明P5具有良好的免疫原性，可刺激機體產生特異性抗血清，效價達到1∶1 600 (圖6)。

2.5 P5蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的相互作用

ELISA體外模擬P5抗血清與嗜水氣單胞菌的相互作用，結果顯示，隨著抗血清稀釋倍數的增大，P5抗血清與嗜水氣單胞菌的結合能力逐漸減弱，當抗體滴度達1∶3 200時，仍可檢測到兩者的相互作用(圖7)。可見，P5抗血清與嗜水氣單胞菌在體外存在相互作用，表明P5蛋白具有良好的抗原性。

2.6 P5蛋白抗血清對紅鯽魚的被動免疫評價

P5抗血清被動免疫紅鯽魚，嗜水氣單胞菌攻毒后觀察試驗魚15 d，發現攻毒后3 d內試驗組魚體出現部分死亡，死亡情況于第4天穩定。對照組48 h內魚體出現大量死亡，隨后死亡率降低，至第5天死亡情況穩定，試驗組與對照組試驗魚存活曲線如圖8所示。試驗魚死亡癥狀為：體表有血斑，魚鰓和各鰭基部充血，腹部突出，肛門紅腫。經統計計算，第5天即死亡情況穩定時試驗組死亡率為32.3%，對照組73.3%，P5抗血清的免疫保護率為56.0%，SPSS 13.0分析顯示與對照組相比差異顯著(表5)，表明P5蛋白抗血清免疫紅鯽魚對嗜水氣單胞菌感染具有一定的免疫保護作用。

2.7 P5蛋白抵抗魚血漿的殺菌作用

體外模擬P5蛋白抵抗魚血漿對嗜水氣單胞菌的殺菌作用，采用Western blotting檢測P5蛋白與魚血漿作用后的差異表達情況。結果顯示，試驗組與對照組P5蛋白均檢測到特異性條帶，且隨著血漿濃度的降低，P5蛋白的表達呈上調趨勢(圖9)，推測P5蛋白可能為孔道蛋白，關閉孔道可以有效抵抗血漿殺菌因子進入細胞而殺傷菌體。

3 結論與討論

嗜水氣單胞菌是水產養殖魚類爆發性傳染病的主要病原菌，也是一種人、畜及水生動物共患的條件致病菌。P5蛋白是嗜水氣單胞菌的主要外膜蛋白之一，具有較強的免疫原性[17]，本研究發現P5蛋白免疫小鼠產生的抗體可增強紅鯽魚對病菌的抵抗力，因此，在疫苗研制方面，P5蛋白具有很好的應用前景。

生物信息學可準確預測蛋白的理化性質、結構與抗原表位，為蛋白功能研究提供參考價值[18]。本研究分析發現，P5為穩定的親水性蛋白，在氣單胞菌屬間進化保守，推測P5蛋白在不同氣單胞菌間功能相近，所產生的抗體可能為多種氣單胞菌提供交叉免疫保護。此外，其二級結構主要以無規則卷曲為主，該結構易扭曲盤旋而暴露在蛋白外層，形成優勢細胞抗原表位的可能性較大[19-20]。蛋白表達由于受到原核表達系統的影響，其最佳表達條件往往是唯一的，本研究發酵試驗發現，菌液OD600為1.0，IPTG終濃度為0.5 mmol/L，32 ℃誘導8 h，P5獲得最大表達量。有研究報道IPTG具有一定毒性，誘導蛋白表達時應添加合適濃度的IPTG，另外，長時間誘導會導致蛋白被細菌蛋白酶降解，不利于蛋白的高效表達[21-22]，本研究也發現適度的誘導劑濃度與誘導時間更利于P5蛋白的高效表達。

研究顯示，外膜蛋白是嗜水氣單胞菌的主要毒力因子之一，能夠激發機體產生高水平保護性抗體，且利用原核表達純化的蛋白免疫動物是制備蛋白多抗的普遍方法[23-24]。毛然然等[25]用純化的OprM蛋白肌肉注射斑馬魚，在轉錄水平檢測到相關免疫基因表達上調，揭示該蛋白可在斑馬魚體內引起免疫應答。Maiti等[26]利用外膜蛋白OmpW在兔體內制備了抗重組蛋白的多克隆抗體，并證實抗體的特異性反應，表明OmpW可能是一種潛在保護原。Khushiramani等[27]用利用重組外膜蛋白Omp48制備了兔抗免疫血清，且免疫Omp48的魚體可有效抵抗嗜水氣單胞菌感染，免疫保護率達到69%。本研究用純化獲得的嗜水氣單胞菌P5蛋白免疫小鼠制備特異性P5多克隆抗血清，抗血清被動免疫紅鯽魚，發現魚體可有效抵抗嗜水氣單胞菌的感染，較對照組免疫保護率達到顯著的56%，可見，嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5具有較強的免疫原性和免疫保護功能。為進一步探究P5的抗原性，體外模擬試驗顯示P5抗血清與嗜水氣單胞菌存在體外識別作用，表明P5也具有良好的抗原性。

體外模擬魚血漿殺菌作用，發現嗜水氣單胞菌進入魚體后，血漿存在非特異性的殺菌作用，P5蛋白表現為下調以抵抗血漿因子識別，該現象可能與所預測P5蛋白三維結構為桶狀相關，推測P5可能通過關閉孔道以減少與血漿殺菌因子的結合，從而達到保護細菌的作用。

綜上所述，嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5在氣單胞菌間進化保守，二級結構以無規則卷曲為主，三維結構呈桶狀。P5蛋白具有較強的免疫原性和抗原性，對紅鯽魚具有顯著的免疫保護作用。此外，P5蛋白可有效抵抗魚血漿對嗜水氣單胞菌殺傷作用。本研究表明嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5是一種良好的保護性抗原，有望作為防治嗜水氣單胞菌蛋白亞單位疫苗的候選抗原成分。