冷凍電子顯微鏡觀察人釉原蛋白的自組裝

賴婷婷 陳亮 張川 田鯤

牙釉質作為最堅硬、最精密的硬組織，其形成過程復雜，需基因表達，細胞分泌，蛋白及酶調控等共同作用，構建從分子、納米至宏觀均高度有序的結構。該過程最重要最基礎的是釉原蛋白發生一系列自組裝反應形成納米球，搭建起釉質細胞外基質最基本的結構實體，再進一步聚集成高級構象作為有機模板，指導羥基磷灰石晶體有序地成核與伸長[1]。釉原蛋白(amelogenin)是釉質形成初期最主要的細胞外基質，占90%[1]，在體外能自組裝成直徑16～70 nm的納米球[2]。通過原子力顯微鏡[3]、小角度X線散射(SAXS)[4]、核磁共振[5]、動態光散射(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)[6]等的研究，納米球結構已被廣泛認可。隨著牙釉質礦化成熟，釉原蛋白逐漸降解、消失，即表現為在牙胚發育早期高度表達，晚期及已礦化期低表達甚至無表達。

釉原蛋白的自組裝過程發生在水性環境中，若進行常規脫水會導致蛋白結構明顯改變。冷凍電子顯微鏡能將蛋白樣品迅速冷卻至玻璃態冰[7]，鏡下結構基本反映冷卻前的瞬時狀態，最大程度減少了脫水偽影，且需要的樣品量少[7]。因此，本實驗采用冷凍電子顯微鏡來觀察人釉原蛋白在體外的自組裝過程，初步探究釉原蛋白的自組裝機制，為體外修復缺損釉質提供思路。

1 材料與方法

完整取出青少年下頜第三磨牙牙囊(處于釉質發育期)1 例(四川省人民醫院口腔正畸科)， InvitrogenTMTRIZOL?試劑(賽默飛世爾，美國)提取牙胚細胞總RNA,根據 Gen Bank 公布的人釉原蛋白全長序列(Genebank M86932)，利用 Primer Premier 5 生物學軟件分析并設計特異性引物，引入酶切位點 Bam H I 和 Sac I。……