MicroRNA-155在原發(fā)性免疫性血小板減少癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及意義

散琴，崔瑩瑩，柯盈月

十堰市婦幼保健院檢驗(yàn)科，湖北 十堰442000

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)屬于臨床上較為常見的一種出血性疾病，亦是免疫性綜合病癥之一[1]。其主要臨床特征為血液循環(huán)內(nèi)存在一定量的抗血小板抗體，從而導(dǎo)致血小板損害明顯，引發(fā)紫癜，且骨髓內(nèi)的巨核細(xì)胞正常或增多，幼稚化，進(jìn)一步促進(jìn)血小板減少[2]。迄今為止，關(guān)于原發(fā)性ITP的具體病因以及發(fā)病機(jī)制尚未徹底明確，近年來研究發(fā)現(xiàn)自身免疫功能異常可能在該病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[3]，其中自身免疫功能的異常可能引起患兒產(chǎn)生抗血小板抗體，進(jìn)一步破壞大量血小板，繼而導(dǎo)致血小板的減少，引起B(yǎng)細(xì)胞過度活化產(chǎn)生抗體，而后輔助性T細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行免疫應(yīng)答，最終引起免疫紊亂并產(chǎn)生細(xì)胞毒性[4-5]。MicroRNA-155轉(zhuǎn)錄源自21號(hào)染色體B細(xì)胞整合簇區(qū)域，和B淋巴細(xì)胞分泌自身抗體密切相關(guān)，可在一定程度上影響B(tài)淋巴細(xì)胞功能[6]，因而MicroRNA-155與ITP的發(fā)病可能存在關(guān)聯(lián)。鑒于此，本文通過研究MicroRNA-155在原發(fā)性ITP患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中的表達(dá)，并分析其與血小板計(jì)數(shù)(platelet count，PLT)、細(xì)胞因子及T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系，旨在初步探明MicroRNA-155在ITP發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取十堰市婦幼保健院2015年2月至2019年6月收治的83例原發(fā)性ITP患兒納入研究(病例組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷參考《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[7]中ITP相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)入院前尚未接受ITP相關(guān)治療；(3)無臨床病歷資料缺失。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因糖尿病、藥物以及自身免疫疾病導(dǎo)致的繼發(fā)性ITP患兒；(2)心、肝、腎等重要臟器受損的患兒；(3)正參與其他研究的患兒。病例組患兒中男性46例，女性37例；年齡4個(gè)月～10歲，平均(4.96±2.12)歲。另選取同期到我院體檢的健康兒童80例作為健康組，其中男性45例，女性35例；年齡4個(gè)月～11歲，平均(4.79±2.10)歲。兩組受檢者的上述指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。入組兒童的監(jiān)護(hù)人均對(duì)研究知情，并在同意書上簽字，研究過程嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.2.1 PBMC中MicroRNA-155表達(dá)水平的檢測(cè) 病例組患兒入院次日、健康組兒童體檢當(dāng)日采集外周靜脈血5 mL，以Ficoll-Hypaque密度梯度法離心分離PBMC，用含2%的胎牛血清磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入TRIzol試劑后提取PBMC中總RNA，具體操作務(wù)必以試劑盒說明書為準(zhǔn)。使用MicroRNA特異的引物及反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA，利用RNA分離試劑盒提取樣品中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品于260 nm以及280 nm處的吸光度，若吸光度在1.8～2.0內(nèi)說明RNA純度良好，隨后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。條件為42℃反應(yīng)1 h，70℃反應(yīng)10 min。使用TaqMan MicroRNA檢測(cè)試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行RT-PCR檢 測(cè)miR-155相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性40 s、95℃變性5 s、60℃反應(yīng)0.5 min，每個(gè)設(shè)置含3個(gè)平行，總共循環(huán)40次。MicroRNA-155引物序列如下：正向：5'-GCGGCGGTTAATGCTAATCGTG-3'，反 向：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAG-3'；以U6作為內(nèi)參，對(duì)照物引物序列為：正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。根據(jù)Ct值以及通過2-△△Ct方法計(jì)算miR-155相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.2.2 PLT、細(xì)胞因子及T細(xì)胞亞群的檢測(cè) 取其余三份血樣，分裝于A、B、C三管，A管采用國產(chǎn)全自動(dòng)血液分析儀(型號(hào)BC-6800)進(jìn)行PLT的檢測(cè)；B管血樣經(jīng)3 000 r/min離心10 min后取上清進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)：細(xì)胞因子主要包含干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，以酶聯(lián)免疫吸附法完成檢測(cè)，具體操作務(wù)必遵循試劑盒說明書進(jìn)行(武漢博士德生物科技有限公司)。C管血樣應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群水平，主要指標(biāo)為Th1、Th17、Th2、Treg，具體操作務(wù)必以儀器相關(guān)說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析PBMC中MicroRNA-155表達(dá)量與PLT、細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者PBMC中MicroRNA-155相對(duì)表達(dá)量及PLT水平比較 病例組患兒PBMC中MicroRNA-155相對(duì)表達(dá)量明顯高于健康組，且PLT水平明顯低于健康組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 兩組受檢者PBMC中MicroRNA-155表達(dá)量及PLT水平比較(±s)

表1 兩組受檢者PBMC中MicroRNA-155表達(dá)量及PLT水平比較(±s)

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2.2 兩組受檢者的血清細(xì)胞因子水平比較 病例組患兒的血清IFN-γ、IL-2水平明顯高于健康組，而IL-4、IL-10水平明顯低于健康組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

表2 兩組受檢者的血清細(xì)胞因子水平比較(±s，pg/mL)

表2 兩組受檢者的血清細(xì)胞因子水平比較(±s，pg/mL)

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2.3 兩組受檢者的T細(xì)胞亞群比較 病例組患兒的Th2、Treg水平明顯低于健康組，Th1水平明顯高于健康組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但兩組的Th17水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 兩組受檢者的T細(xì)胞亞群比較(±s，%)

表3 兩組受檢者的T細(xì)胞亞群比較(±s，%)

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2.4 PBMC中MicroRNA-155相對(duì)表達(dá)量與PLT、細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：PBMC中MicroRNA-155相對(duì)表達(dá)量與PLT、IL-4、IL-10、Treg、Th2水平均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，而與IFN-γ、IL-2、Th1水平均呈正相關(guān)(P＜0.05)，與Th17無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見表4。

表4 PBMC中MicroRNA-155相對(duì)表達(dá)量與PLT、細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群的相關(guān)性

3 討論

ITP作為臨床多見的自身免疫性出血性疾病之一，其發(fā)病原因以及機(jī)制仍處于探索階段，因此臨床上尚無治療ITP的特異性手段[8-9]。目前有研究認(rèn)為ITP可能和T細(xì)胞亞群紊亂有關(guān)，如Th1、Th2細(xì)胞的平衡紊亂與ITP的發(fā)病有關(guān)，Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致ITP病情加重[10]，Th17細(xì)胞作為新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，其與自身免疫病存在較為明顯的聯(lián)系[11]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)ITP患者體內(nèi)多種細(xì)胞以及體液中存在多種MicroRNA表達(dá)異常現(xiàn)象[12-13]，提示MicroRNA表達(dá)異常可能參與了ITP的發(fā)生、發(fā)展過程。MicroRNA-155屬于MicroRNA家族成員之一，隨著其表達(dá)逐漸升高，機(jī)體B細(xì)胞會(huì)被過度激活，進(jìn)一步合成、分泌大量特異性抗體，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)亢進(jìn)的發(fā)生，繼而促進(jìn)了免疫性疾病的發(fā)生[14-15]。另有相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)，MicroRNA-155在系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及重癥肌無力等一系列自身免疫性疾病中均存在異常表達(dá)[16-17]。由此，本文通過檢測(cè)MicroRNA-155在ITP患兒PBMC中的表達(dá)水平，旨在初步探討其在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組PBMC中MicroRNA-155相對(duì)表達(dá)量顯著高于健康組，PLT低于健康組，提示了MicroRNA-155在ITP患兒PBMC中存在明顯高表達(dá)，且可能參與了ITP的發(fā)生、發(fā)展過程。分析原因?yàn)锽淋巴細(xì)胞內(nèi)的MicroRNA-155可能是通過對(duì)自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生過度激活作用，繼而促進(jìn)IgG以及IgM等特異性抗體的合成與分泌，參與血小板的破壞，最終引發(fā)ITP的發(fā)生，這與郭瑩等[18]的研究報(bào)道相吻合。此外，ITP的發(fā)生可能和原發(fā)感染導(dǎo)致的長期免疫應(yīng)答異常有關(guān)，從而促進(jìn)了免疫球蛋白和血小板表面抗原的結(jié)合，進(jìn)一步誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞NK進(jìn)行外毒素分泌型的細(xì)胞毒性作用損傷血小板，最終導(dǎo)致PLT的明顯下降。IFN-γ、IL-2主要是由Th1細(xì)胞分泌，主要作用是直接殺傷抗原遞呈細(xì)胞或活化殺傷性細(xì)胞，繼而參與細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)；而IL-4、IL-10主要是由Th2細(xì)胞分泌而來，可直接抑制殺傷性細(xì)胞或促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化增殖產(chǎn)生抗體，進(jìn)一步參與體液免疫。本研究結(jié)果顯示病例組血清IFN-γ、IL-2水平顯著高于健康組，而IL-4、IL-10水平均顯著低于健康組，這提示了Th1、Th2細(xì)胞失衡可能參與了ITP的發(fā)生、發(fā)展過程。究其原因，IFN-γ、IL-2分泌增加會(huì)導(dǎo)致免疫環(huán)境紊亂，影響CD4+T細(xì)胞增殖分化為Th2類細(xì)胞，從而減少了Th2類細(xì)胞因子的產(chǎn)生；而IL-4、IL-10可抑制CD4+T細(xì)胞增殖分化為Th1類細(xì)胞，導(dǎo)致Th1分泌的細(xì)胞因子減少，正常生理狀態(tài)下二者處于動(dòng)態(tài)平衡[19-21]，而隨著IFN-γ、IL-2水平的升高以及IL-4、IL-10水平的降低，勢(shì)必導(dǎo)致Th1增加，Th2減少，引起Th1、Th2細(xì)胞失衡，進(jìn)一步促進(jìn)大量血小板抗體的生成，同時(shí)激活了單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能，導(dǎo)致大量被致敏的血小板被吞噬消滅，最終引發(fā)了ITP[22]。這在王瑩等[23]的研究報(bào)道中得以佐證：ITP患兒存在明顯的T淋巴細(xì)胞亞群失衡，且存在不同程度的細(xì)胞因子紊亂。然而，上述研究分析了不同年齡階段ITP患兒的細(xì)胞因子表達(dá)水平差異，而本研究并為進(jìn)行該方面的研究，這為我們今后的研究提供了新的方向。另外，Pearson相關(guān)性分析顯示PBMC中MicroRNA-155表達(dá)量與PLT、IL-4、IL-10、Treg、Th2水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與IFN-γ、IL-2、Th1水平均呈正相關(guān)關(guān)系，初步說明MicroRNA-155可能是通過影響IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-2的合成與分泌，進(jìn)而對(duì)患兒的免疫系統(tǒng)造成影響，進(jìn)一步介導(dǎo)ITP的發(fā)生、發(fā)展，但其具體的影響機(jī)制尚待日后進(jìn)一步探討明確。然而，本研究尚且存在樣本量較少的缺陷，可能導(dǎo)致研究結(jié)果發(fā)生偏頗，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。

綜上所述，ITP患兒的PBMC中MicroRNA-155存在明顯高表達(dá)，且與PLT、IL-4、IL-10、Treg及IFN-γ、IL-2、Th1、Th2水平均具有一定的相關(guān)性，可能通過影響免疫系統(tǒng)參與了ITP的發(fā)病過程，具有作為ITP患兒治療靶點(diǎn)的潛力。