藿香正氣散治療新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀的網絡藥理學研究

施 敏 劉富林 夏旭婷 張 婷 廖陳敏

湖南中醫藥大學中醫學院，湖南長沙 410208

2019 年12 月以來，由新型冠狀病毒感染引起的肺炎對全球人類健康造成極大威脅，其臨床癥狀主要為發熱、咳嗽、乏力等，并可能導致多種危急重癥[1]。新型冠狀病毒肺炎伴隨的納差、惡心嘔吐、腹瀉、黑便發生率分別為53.8%、21.3%、41.3%、2.5%[2]，這些胃腸道癥狀為目前臨床的難點之一。疫情發生后，習近平總書記要求中醫藥進入防控疫情的主戰場。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[3]指出，可運用藿香正氣散治療新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀，本文基于網絡藥理學分析藿香正氣散治療新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀的作用機制，希望為后續研究提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分及作用靶基因、疾病靶基因的檢索與交集靶基因的獲取

借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP），以“藿香、紫蘇、白芷、厚樸、大腹皮、半夏、陳皮、桔梗、茯苓、白術、甘草、生姜、大棗”為關鍵詞檢索，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為標準，篩選化學成分及作用靶基因，并對靶點進行規范。通過GeneCards數據庫、人類孟德爾遺傳綜合數據庫（OMIM）以“Novel Coronavirus Pneumonia、diarrhea、nausea、vomiting”為關鍵詞檢索新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀的靶基因。將中藥活性成分作用靶基因與疾病靶基因導入Venny 2.1 平臺獲取交集靶基因。

1.2 構建中藥成分-靶基因網絡圖及核心成分篩選

借助Cytoscape 3.7.2 軟件構建中藥成分-疾病靶基因網絡圖，利用CytoNCA 插件進行拓撲分析，選取滿足度值（Degree）和中心性（Betweenness）≥2 倍中位數的節點為藿香正氣散治療新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀的核心成分。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）核心網絡的構建

將交集基因導入String 數據庫進行靶基因間的PPI 分析，物種選擇為人，設定置信度＞0.4，得到PPI網絡圖，并借助R 語言構建核心網絡。

1.4 核心靶基因的通路分析

應用R 語言，設定閾值為P ＜0.05，進行GO 和KEGG 通路分析，通過生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組成（CC）3 大模塊進行GO 富集分析。

1.5 分子對接

選取核心靶基因和主要活性成分，在蛋白質結構數據庫（PDB）下載靶點蛋白的結構，在TCMSP 下載化合物結構，導入SwissDock 進行對接。

2 結果

2.1 藿香正氣散活性成分及作用靶基因、疾病靶基因、交集靶基因的篩選

經檢索并篩選到藿香正氣散活性成分224 個，對應作用靶點4026 個，去重后得到165 個活性成分和261 個作用靶基因，藿香正氣散各成分和作用靶基因數見表1。新型冠狀病毒肺炎靶基因有261 個、胃腸道癥狀有7756 個，其中交集靶基因50 個，見圖1。

表1 藿香正氣散活性成分及作用靶基因

圖1 藿香正氣散與新型冠狀病毒肺炎靶基因韋恩圖

2.2 藿香正氣散活性成分-靶基因網絡圖及核心成分

藿香正氣散活性成分-靶基因網絡圖見圖2，其核心成分見表2。

圖2 藿香正氣散活性成分-靶基因網絡圖

2.3 PPI 網絡的構建及核心靶基因

PPI 網絡圖和核心靶基因柱狀圖見圖3。其中邊代表靶基因之間的關聯，邊越粗（顏色越深），結合度越大；節點代表作用靶基因，共有49 個節點、477 條邊。

圖3 蛋白-蛋白相互作用網絡與核心基因柱狀圖

2.4 核心靶基因的通路分析

GO 功能富集分析得到條目共1579 個，其中BP 為1456 個，MF 為33 個，CC 為90 個，其中各項基因數由多到少排序前五的見表3。KEGG 通路富集分析得到133 條信號通路，主要有腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等。KEGG 通路富集分析結果前20 的條形圖和氣泡圖（顏色代表富集程度，條形長度、氣泡大小代表富集的基因數目）見圖4。

圖4 藿香正氣散治療新型冠狀病毒肺炎的核心靶基因KEGG 富集分析

表2 藿香正氣散核心成分

2.5 分子對接

分子對接結果見表4。蛋白質與小分子結合越緊密，其結合能越低，IL-6 靶點與柚皮素結合比較緊密（結合能=-4070.51 kJ/mol），見圖5。

3 討論

新型冠狀病毒肺炎發于冬春季節，屬于疫戾致病，結合本病高度的傳染性和臨床證候的相似性[4]，患者均以發熱、干咳、乏力為主要表現，多伴惡心、脘痞、腹脹、便溏等胃腸道癥狀，屬于中醫疫病范疇，因感受外來疫戾之氣，以濕為主，為濕毒疫，濕毒之邪波及中、下焦之脾胃、腸道，表現為濕困脾閉肺，肺失宣降，氣郁身熱。肺宣發肅降助氣血津液分布于全身，宣發肅降功能正常，則大腸之氣通暢，出入有常，分清別濁，反之則大腸傳化失司，新型冠狀病毒肺炎患者病位在肺，肺的宣發肅降功能失調，故患者出現腹脹、便溏等[5]。王遙等[6]認為肺腸合治，宣肺通腑、分消走泄、祛除疫邪為新型冠狀病毒肺炎的關鍵治法。根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[3]，新型冠狀病毒肺炎臨床表現為乏力伴腸胃不適者，推薦使用藿香正氣相關中成藥治療。藿香正氣散出自《太平惠民和劑局方》，有解表化濕、理氣和中的功效，可改善免疫功能、抗菌、抗病毒、調節胃腸道功能、鎮吐等，用于治療肺系胃腸道疾病[7]。霍志鵬等[8]認為藿香正氣散可減輕新型冠狀病毒肺炎患者的炎癥反應，有保護炎癥導致的器官損傷作用，并可減緩炎癥的進展速度，可能與降低促炎性細胞因子水平、升高IL-10 水平及調節炎癥NF-κB 通路有關。

本研究提示藿香正氣散中柚皮素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、陳皮素等化合物作用于新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀相關的原癌基因（JUN）、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、MAPK14、促生存因子基因（BCL2L1）、表皮生長因子受體（EGFR）、IL-6 等50 個靶點。

柚皮素具有抗氧化、抗感染、抗腫瘤、抗凋亡等多種生物活性[9]。陳皮素具有抗感染、抗癌、抗血栓、抗癲癇、抗血凝、抗真菌、抗過敏、抗感染、抗膽堿酯酶等作用，并可緩解小鼠金黃色葡萄球菌肺炎的損傷[10-11]。木犀草素具有抗感染、抗病毒等藥理作用，且有保護肺臟作用，可能與其抑制NF-κB 信號通路的表達、抑制IL-6、TNF-α 的釋放有關，另外其還可干預細胞凋亡，達到抑制病毒的作用[12-14]。槲皮素具有降血壓、抗氧化、抗感染、調節免疫功能等作用[15-17]。山奈酚對氧化應激及細胞凋亡均具有抑制作用，可減輕豬源甲型H9N2 流感病毒所致小鼠急性肺損傷[18-19]。

表3 藿香正氣散治療新型冠狀病毒肺炎的核心靶基因GO 富集分析各項排序前五的條目

表4 分子對接結果（kJ/mol）

圖5 白細胞介素-6 靶點與柚皮素的分子對接

JUN 被激活后可提升腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力，新型冠狀病毒肺炎病理過程中產生的各種細胞、炎癥反應因子均可促進JUN 的表達[20]。MAPK8 在細胞增殖、分化、生存、死亡，炎癥及其他病理過程中起著重要的調控作用，MAPK14 可通過炎性細胞因子的刺激被激活，可調節細胞的生長、分化及對環境的應激適應、炎癥反應等多種重要的病理生理過程[21]。BCL2 不僅能抑制多種細胞的凋亡，還可阻止細胞色素C 從線粒體中釋放，使其不能與凋亡激活因子結合來抑制caspase 活性[22]。EGFR 可以通過結合表皮生長因子啟動細胞核內信號的導轉，參與調控EGFR 信號通路，抑制血管內皮細胞生長因子受體的表達，抑制酪氨酸激酶活性，減輕氣道重塑與抑制氣道炎癥反應[23-24]。IL-6 作為非特異性炎癥因子，在炎癥早期就顯著升高，參與肺臟炎癥的發生、發展[25]。

富集分析結果發現藿香正氣散的GO 功能富集主要體現在對細菌起源分子的反應、對氧化應激的反應、細胞對細菌起源分子的反應、細胞因子活性、磷酸酶結合等，主要通過調控與病毒感染和炎癥及免疫相關的通路治療新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀。KEGG 通路富集分析篩選得到的通路主要有TNF 信號通路、IL-17 信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等，大多數基因富集于與病毒有直接關系的通路上，可推斷出藿香正氣散通過作用于與病毒直接相關的通路，從而起到抗病毒的作用，機制是通過抗病毒、抗感染、調控細胞凋亡、調節免疫等途徑。分子對接結果顯示IL-6 靶點與藿香正氣散主要成分柚皮素的結合比較緊密，柚皮素有與IL-6 受體結合的潛力，從而治療新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀。

藿香正氣散中有效化合物可能通過多途徑多通路作用于多靶點發揮抗病毒、抗感染及調節免疫等作用，提示藿香正氣散可以通過多化合物-多靶點-多通路保護機體臟器、抗病毒、抗感染、調控細胞凋亡、調節免疫，治療新型冠狀病毒肺炎伴胃腸道癥狀，體現了中醫藥“多點顯效，協同增效”的特點。