黃芩苷對變異鏈球菌UA159體外的抑制作用

吳菊， 王玲， 劉興容

西南醫科大學口腔醫學院，西南醫科大學附屬口腔醫院兒童口腔科，四川 瀘州（646000）

齲病是常見的口腔細菌性疾病之一，不僅會影響患者咀嚼功能，還會影響患者言語、面部表情，甚至會影響患者的心理健康［1?2］。研究表明，變異鏈球菌可通過黏附、產酸和耐酸作用破壞牙體組織而形成齲壞。黃芩是一種具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗菌等多種生物活性的中藥，可用于治療呼吸道感染、肺炎、結腸炎、肝炎和過敏性疾病［3］。黃芩苷（baicalin）是從黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要活性成分，僅在黃芩的根部黃芩苷的含量就可以達10.11%［4］。研究表明，黃芩能夠抑制痤瘡丙酸桿菌引起的白細胞介素?1β（interleukin?1β，IL?1β）和IL?8 水平的上調［5］；黃芩苷能夠抑制銅綠假單胞菌的生物膜形成［6］。本文旨在探討黃芩苷對變異鏈球菌的抑菌作用；測定黃芩苷在體外環境中對變異鏈球菌UA159 的最低抑菌濃（minimum inhibitory concentration，MIC）；觀察不同濃度黃芩苷對變異鏈球菌UA159 生長、黏附能力及生物膜形成的影響，為其在齲病防治中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與試劑

變異鏈球菌國際標準株UA159（以下簡稱UA159）由四川大學華西口腔醫學院國家重點實驗室提供。BHI 瓊脂培養基、BHI 液體培養基、磷酸鹽緩沖液、黃芩苷、二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司，中國）、50%戊二醛（成都市科隆化學品有限公司，中國）、結晶紫染色液（上海碧云天生物技術有限公司，中國）、一次性無菌接種環（Bilogix Group，美國）、Millex?GP 0.22 μm 微孔濾膜（Milli?pore 公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體倍比稀釋法測定UA159 的MIC 值 取10 支試管，編號1～10。1、2、8 號試管中加入1 mL黃芩苷藥液（濃度為48 mg/mL），2～7、9、10 試管中加入1 mL BHI液體培養基，1～7號管內按二倍梯度稀釋，黃芩苷藥液濃度依次為48、24、12、6、3、1.5、0.75 mg/mL；第8 管為藥液對照組，藥液濃度為48 mg/mL；第9 管為溶劑對照組，藥液濃度為0 mg/mL；第10 管為菌液對照組，藥液濃度0 mg/mL。取凍存變異鏈球菌UA159 菌株，復蘇傳代，厭氧培養24 h；經鏡檢確定為純培養后，取單個菌落接種于BHI 液體培養基中，在37 ℃、厭氧培養18 h；離心，無菌PBS 漂洗3 次；離心并用BHI 液體培養基稀釋重懸，調整菌液吸光度為OD600＝1.0；BHI液體培養基稀釋UA159菌懸液100倍后，加入到1～7號、9號及10號試管中；8 號試管中加入等體積的BHI 液體培養基。酶標儀測37 ℃厭氧箱培養0、24 h 后各試管內UA159 的OD600值，計 算24 h 后 的OD 增 長 值，即ΔOD600值。每個濃度取樣3次，記錄數值取平均值。1.2.2 UA159 生長曲線測定 取5 支試管，編號1～5。BHI 液體培養基分別稀釋黃芩苷藥物至MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 濃度，分別0.5 mL 加入1～4 號試管中；5 號試管為加入BHI 液體培養基0.5 mL 作為菌液對照組；5 支試管中均加入0.5mL BHI 液體培養基稀釋100 倍后的UA159 菌懸液。酶標儀測37 ℃厭氧箱培養0、4、8、12、16、24 h 后各試管內UA159 的OD600值，實驗重復3 次，計算OD600均值，繪制UA159 的生長曲線。

1.2.3 不同濃度的黃芩苷對UA159 黏附能力影響 取5 支試管，編號1～5；將1%蔗糖BHI 液體培養基分別稀釋黃芩苷藥物至MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 濃度，分別加入1.5 mL 于1～4 號試管，5 號試管加入1%蔗糖BHI 液體培養基1.5 mL。5 支試管中各加入1.5 mL 稀釋100 倍后的菌懸液，將5 支試管傾斜30 °，置于37 ℃厭氧箱孵育18 h 后取出。孵育18 h 后，試管內液體均倒入第二批相應編號的試管中，原試管中各加入3 mL PBS 液。輕輕洗滌震蕩，將洗滌液移至第三批相應編號的試管中，原試管中再次加入3 mL PBS 液，刮下原試管壁上的全部細菌。將第二、三批試管離心，棄上清液，再加入3 mL PBS 液。酶標儀測定三批試管中UA159 的OD600值，取3 次。第一、二、三批試管內OD600值分別對應為X、Y、Z 值，計算細菌的黏附率及黏附抑制率；黏附率＝X/（X+Y+Z）×100%；黏附抑制率＝（菌液組黏附率?實驗組黏附率）/菌液組黏附率×100%。

1.2.4 黃芩苷對UA159 生物膜形成量的影響 取96 孔板，1～5 號孔中分別加入100 μL BHI 液體培養基稀釋100 倍后的UA159 菌懸液，每孔設置3 個復孔。厭氧培養24 h，在第0 h、6 h、12 h，分別在1～3 號及復孔中加入100 μL 含20 mg/mL 的黃芩苷藥液的BHI 液體培養基。設置4 號溶劑對照組和5 號菌液對照組。24 h 后取出孔板，吸棄培養液，無菌PBS 緩沖漂洗3 次，干燥，甲醛固定；洗去甲醛，每孔加入1%結晶紫染色液200 μL，靜置5 min 吸出，PBS 緩沖液漂洗3 次，室溫干燥。每孔加入33%冰乙酸溶液200 μL，37 ℃恒溫培養箱中作用30 min 后，酶標儀測定OD600值以評估生物膜的形成的量。

1.2.5 掃 描 電 鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察黃芩苷對UA159 細菌總量的影響 重復1.2.4 方法稀釋UA159 菌液，取2 個一次性無菌6 孔板，其中10 個孔中均置入22 mm×22 mm 無菌蓋玻片，加入菌液1 mL，分5 組，每組2 孔，厭氧培養24 h，在第0、6、12 h 這三個時間點，分別在1、2、3 組的每個孔中加入1 mL 20 mg/mL 的黃芩苷藥液，使得最終黃芩苷藥液濃度為10 mg/mL。設置溶劑對照組和菌液對照組。取出6 孔板，吸干菌液，無菌PBS 溶液漂洗，吸棄；加入2 mL 的2.5%戊二醛溶液，加蓋放入4 ℃冰箱中固定4 h；吸棄孔內戊二醛溶液，無菌PBS 溶液漂洗，PBS 緩沖液漂洗2 次；依次用50%、70%、80%、90%酒精梯度脫水，無水乙醇脫水2 次，室溫干燥。每組選取1 枚化蓋玻片CO2臨界點干燥粘臺，噴金。SEM 下觀察，拍照存圖。

1.3 統計學分析

采取SPSS Statistics20.0 進行分析，定量資料采用±s表示。組間比較采用單因素方差分析；Lev?en 檢驗方差齊性，方差齊性采用LSD 法分析；方差不齊采用Dunnett's 法分析；P＜0.05 表示差異具有統計學意義

2 結 果

2.1 黃芩苷對UA159 的MIC 值

試管1、2 號表現為清亮無渾濁沉淀生長的淡黃色液體，而試管3～7 號、9 號與10 號表現為淡黃色渾濁液體或有沉淀。ΔOD600值結果見表1，經過單因素方差分析，各組間差異有統計學意義（F＝2435.346，P＜0.05），根據結果所示，結合以肉眼觀察試管內液體清亮無渾濁或沉淀的最低藥物濃度為黃芩苷的MIC，測得黃芩苷對變異鏈球菌UA159的MIC 值為12 mg/mL。

表1 變異鏈球菌UA159 在不同黃芩苷濃度下的ΔOD600值Table 1 ΔOD600 value of Streptococcus mutans UA159 at different baicalin concentrations ±s，n＝3

表1 變異鏈球菌UA159 在不同黃芩苷濃度下的ΔOD600值Table 1 ΔOD600 value of Streptococcus mutans UA159 at different baicalin concentrations ±s，n＝3

P value:compared with tube 10(bacteria control group)

Tube numer P 123456789 Baicalin concentration（mg/mL）24 12 63 1.5 0.75 0.375 24 10 00 ΔOD600值0.046±0.007 0.094±0.001 0.182±0.004 0.265±0.002 0.377±0.003 0.377±0.005 0.378±0.008 0.020±0.005 0.377±0.007 0.380±0.005＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.406 0.544 0.595＜0.001 0.496-

2.2 生長曲線測定

由2.1 結果已知MIC 為黃芩苷對變異鏈球菌UA159的MIC值為12 mg/mL，則設置MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC 濃度分別為12、6、3、1.5 mg/mL。變異鏈球菌UA159的生長速度隨著黃芩苷藥液濃度的增加而變慢。在0～12 h內菌液組增長迅速，后速度變緩，進入穩定期；1.5 mg/mL 藥液組與菌液對照組相比在0 h、4 h時OD600值較低，差異有統計學意義（P＜0.001），12、6、3 mg/mL 三組與菌液對照組（0 mg/mL）各個時間點相比，OD600值均較低，差異均有統計學意義（P＜0.001），不同黃芩苷濃度組組間相互比較差異均有統計學意義（P＜0.001）。見表2、圖1。

2.3 黃芩苷對變異鏈球菌UA159 黏附的影響

變異鏈球菌UA159 在37 ℃厭氧培養18 h 后黏附率為42.33%；隨著黃芩苷藥液組濃度的增加，變異鏈球菌UA159 黏附率下降；經單因素方差分析，各組間差異有統計學意義（F＝760.401，P＜0.05）；各濃度組與菌液對照組組（0 mg/mL）相比，其差異均有統計學意義（P＜0.05）。根據黏附率計算得出各組的黏附抑制率顯示：隨著黃芩苷藥液濃度的增加黏附抑制率在增加，各組間差異有統計學意義（F＝667.282，P＜0.05）。且各組間兩兩比較，其差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2 變異鏈球菌UA159 在不同時間點不同黃芩苷濃度下的ΔOD600值Table 2 ΔOD600 value of Streptococcus mutans UA159 at different concentrations of baicalin at different time points ±s，n＝3

表2 變異鏈球菌UA159 在不同時間點不同黃芩苷濃度下的ΔOD600值Table 2 ΔOD600 value of Streptococcus mutans UA159 at different concentrations of baicalin at different time points ±s，n＝3

P1: 12 mg/mL group vs. 0 mg/mL group; P2: 6 mg/mL group vs. 0 mg/mL group; P3: 3 mg/mL group vs. 0 mg/mL group; P4: 1.5 mg/mL group vs. 0 mg/mL group

Time（h）Baicalin concentration P F 12 mg/mL 0.123±0.002 0.174±0.005 0.211±0.005 0.277±0.003 6 mg/mL 0.152±0.002 0.236±0.008 0.315±0.009 0.327±0.003 3 mg/mL 0.184±0.004 0.311±0.005 0.411±0.003 0.452±0.005 1.5 mg/mL 0.192±0.003 0.375±0.003 0.458±0.004 0.466±0.003 0 mg/mL 0.211±0.004 0.380±0.002 0.466±0.003 0.473±0.002 P1 P2 P3 P4 48 12 24 349.182 895.601 1 180.943 2 197.682＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.246 0.103 0.068

Figure 1 Growth curves of Streptococcus mutans UA159 at different concentrations of baicalin圖1 變異鏈球菌UA159 在不同黃芩苷濃度下的生長曲線

表3 不同黃芩苷濃度對變異鏈球菌UA159 黏附的影響Table 3 Effects of different concentrations of baicalin on adhesion of Streptococcus mutans UA159±s，n＝3

表3 不同黃芩苷濃度對變異鏈球菌UA159 黏附的影響Table 3 Effects of different concentrations of baicalin on adhesion of Streptococcus mutans UA159±s，n＝3

*：compared with 0 mg/mL group，P＜0.05；△：group comparison，P＜0.05

Baicalin concentration 12 mg/mL 6 mg/mL 3 mg/mL 1.5 mg/mL 0 mg/mL Adhesion rate（%）28.00±0.36*31.13±0.47*33.06±0.20*35.47±0.40*42.32±0.45 Adhesion inhibition rate（%）33.83±0.92△25.77±2.18△22.18±0.69△16.18±0.71△0

2.4 黃芩苷對變異鏈球菌UA159 的生物膜形成的影響

黃芩苷對變異鏈球菌UA159 生物膜形成量的影響結果見表4，經單因素方差分析，各組間差異有統計學意義（F＝958.613，P＜0.05）。與菌液組相比，0、6、12 h 時加入黃芩苷藥液干預變異鏈球菌生物膜形成的差異是有統計學意義的（P＜0.001），而溶劑組細菌生物膜形成的差異無統計學意義（P＝0.304）。

表4 黃芩苷對變異鏈球菌UA159 的生物膜形成量的影響Table 4 Effects of baicalin on biofilm formation of Streptococcus mutans UA159 ±s，n＝3

表4 黃芩苷對變異鏈球菌UA159 的生物膜形成量的影響Table 4 Effects of baicalin on biofilm formation of Streptococcus mutans UA159 ±s，n＝3

P value:compared with bacteria control group

Group 0 h 6 h 12 h Solvent control Bacteria control OD600 0.132±0.003 0.247±0.007 0.288±0.006 0.376±0.004 0.381±0.007 P＜0.000＜0.000＜0.000 0.304-

2.5 SEM 觀察黃芩苷對變異鏈球菌UA159 細菌總量的影響

SEM 下觀察菌株背景為灰黑色，細菌菌體為亮白色，圓形。變異鏈球菌UA159 培養24 h 后生長良好（圖2a、2b）。0 h 加入黃芩苷后UA159 菌體均基本以成對狀（圖2c、2d）；6 h 加入黃芩苷后細菌總量明顯下降（圖2e、2f）；12 h 時加入黃芩苷后細菌總量明顯下降（圖2g、2h）。溶劑對照組（圖2i、2j）與菌液對照組相比，無明顯差異。

3 討 論

牙菌斑的形成與發育需要多種細菌的參與，變異鏈球菌血清型c、e、f 是已知的致齲菌［8?9］。變異鏈球菌通過使牙體硬組織脫礦導致齲齒形成［10］。目前臨床上常用的防齲方法有氟化物防齲、氯己定防齲等。研究表明，氟化物雖然對變異鏈球菌生物膜具有抗酸作用，但短暫的氟化物處理不能維持對生物膜中的變形鏈球菌的抗酸活性，生物膜的損害可以隨著時間的推移而恢復［11］。氟化物的濫用易導致耐氟菌株的出現，過量使用會導致人體氟中毒，出現氟骨癥、氟斑牙等。天然藥物具有毒副作用小、不易造成菌群失調等優點，已有研究發現，黃柏、肉桂、丁香、金針菇提取物等天然藥物對變異鏈球菌都有抑制作用［12?14］。黃芩苷作為一種天然的抑菌藥物，目前國內外關于黃芩苷與變異鏈球菌致齲性研究比較少見。

Figure 2 Effects of baicalin on the total number of Streptococcus mutans UA159 bacteria was observed under SEM圖2 掃描電鏡下觀察黃芩苷對變異鏈球菌UA159 細菌總量的影響

3.1 黃芩苷對變異鏈球菌生長的影響

本實驗采用液體二倍稀釋法結合酶標儀測定天然藥物黃芩苷對變異鏈球菌生長的作用，結果顯示黃芩苷對變異鏈球菌UA159 的MIC 值為12 mg/mL。在生長實驗中，把變異鏈球菌UA159 添加到質量濃度為12、6、3、1.5 mg/mL 的黃芩苷及無藥液的BHI 培養基內，從不同時間點的OD600值看出，加入黃芩苷的變異鏈球菌UA159 與標準變異鏈球菌UA159 生長趨勢上基本一致，但菌液濃度均低于標準變異鏈球菌UA159 組，推測其原因可能是黃芩苷可能并不影響變異鏈球菌UA159 生長的基本趨勢，但會影響變異鏈球菌UA159 增殖速度。

3.2 黃芩苷對變異鏈球菌黏附的影響

黏附是細菌在宿主內定居的第一步，變異鏈球菌對牙面的黏附是其定植、致齲的基礎。變形鏈球菌菌株產生三種葡糖基轉移酶（glucosyl trans?ferase，GTF），包括GTF?B、GTF?C 和GTF?D，它們利用蔗糖作為底物來合成葡聚糖；變異鏈球菌還具有多種高親和力表面粘附素，即使在沒有蔗糖的情況下也能夠定植［15］。黏附素在變異鏈球菌與基質的黏附中發揮重要作用，黏附素包含葡糖基轉移酶、葡聚糖結合蛋白、變異鏈球菌表面蛋白P1等。本實驗結果顯示，變異鏈球菌UA159 在37 ℃厭氧培養18 h 后黏附率為42.33%；隨著黃芩苷藥液組濃度的增加，變異鏈球菌UA159 黏附率下降，對細菌的黏附抑制率在增加；表明黃芩苷具有抑制變異鏈球菌黏附的作用。黃芩苷抑制變異鏈球菌黏附的具體抑制機制尚不清楚，可能與黏附相關因子或者黏附相關基因有關，有待進一步研究。

3.3 黃芩苷對變異鏈球菌生物膜形成及細菌總量的影響

口腔內牙菌斑形成過程比較復雜，以下三階段：獲得性膜形成階段、細菌附著階段、菌斑成熟階段，細菌表面的受體可在獲得性膜形成后，與之結合，可共同抵抗有滲透作用的藥物，同時還可加強其他微生物對牙釉質的黏附作用［16］。變異鏈球菌分泌的胞外多糖，容易與結晶紫結合，胞外多糖與結晶紫的結合物在600 nm 波長下有最大吸收，因此，為了反映生物膜的生成量，本實驗采用酶標儀在600 nm 波長下測定OD 值，OD 值越小表示生物膜的生成量越小，即藥物對生物膜的抑制作用越強。本實驗發現：在0、6、12 h 時加入黃芩苷藥液均可影響變異鏈球菌UA159 生物膜形成的量，DMSO 溶液不會影響細菌生物膜形成的量，說明黃芩苷對變異鏈球菌UA159 生物膜形成有很好的抑制效果。

電子顯微鏡顯著優于光學顯微鏡的一大特點是它的高分辨率，目前超高分辨率掃描電鏡分辨率高達0.4 nm。本實驗通過SEM 觀察到10 mg/mL的黃芩苷在0、6、12 h 時加入均可影響UA159 在體外蓋玻片上形成的細菌總量的密度，表明在變異鏈球菌UA159 形成的不同時期加入黃苓苷均使細菌總量顯著減少。

4 小 結

本實驗通過天然藥物黃芩苷對致齲菌變異鏈球菌在體外環境中進行研究，得出以下結論：①黃芩苷對變異鏈球菌UA159 的MIIC 值為12 mg/mL；②黃芩苷并不影響變異鏈球菌基本的生長趨勢，但會降低其生長增殖的速度；③黃芩苷可以抑制變異鏈球菌的黏附，但并不能完全使變異鏈球菌喪失黏附能力；④黃芩苷可以減緩變異鏈球菌細菌生物膜的形成速度，但不能完全阻斷細菌生物膜的形成；⑤黃苓苷對變異鏈球菌形成的不同時期均有抑制作用。

【Author contributions】Wu J performed the experiments and wrote the article. Wang L collected the data. Liu XR designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.