低氧誘導因子?1α對骨髓間充質干細胞成骨分化與血管生成相關因子的影響

左新慧， 李君， 韓祥禎， 劉小元， 何惠宇，2

1.新疆醫科大學第一附屬醫院（附屬口腔醫院）口腔修復科，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊（830054）；

2.新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊（830011）

組織工程骨為解決骨組織的缺損和修復提供了新的方向，其中種子細胞、細胞因子與支架材料是構成組織工程骨的三大要素。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化和自我更新的功能，可作為理想的種子細胞［1?2］，成熟的基因治療技術也為細胞構建更加穩定的生長環境，延緩其老化過程，促使細胞增殖能力和分化能力等提供了可靠的方法［3］。低氧誘導因子?1α（hypoxia?inducible factor?1α，HIF?1α）通過調控其編碼相對應的生長因子產物，可以直接或者間接參與血管發生的整個過程。研究發現在骨缺損修復過程中HIF?1α 也發揮著調控作用，其通過不同途徑誘導成骨因子的生成，進而促進缺損部位血管生成［4］。利用RNA 干擾（RNAi）技術使目的基因表達沉默，具有高特異性［5］。

本研究通過體外實驗上調和下調BMSCs 中的HIF?1α 的表達，觀察各組BMSCs 中的成骨和血管生成相關因子的變化，探究HIF?1α 對BMSCs 成骨分化和血管生成相關因子表達的影響，為HIF?1α在骨組織工程中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

HIF?1α 過表達質粒和低表達質粒（由上海吉凱基因科技有限公司提供）；清潔級SD 大鼠，雌雄不限，體重（100 ± 10）g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（新）2016?0003。

主要試劑：MEM basic（1 ×）培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（BI，美國）；0.25%胰蛋白酶（Hy?Clone，美國）；質粒提試劑盒（BIOMIGA，美國）；限制性內切酶（Thermo，美國）；Lip LTX 轉染試劑盒（Invitrogen，美國）；茜素紅染色液（北京索萊寶公司，中國）；引物序列（上海生物工程公司，中國）；QuantiNova?SYBR?Green PCR Kit 試 劑 盒（QIA?GEN，德國）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo，美國）；Rabbit?Anti?HIF?1α?antibody（Abcam，美國），Rabbit?Anti?Runx2?antibody（Abcam，美國），Rabbit ?Anti?PDGF?BB?antibody（Abcam，美國），Rabbit?Anti?GAPDH?antibody（Abcam，美國）。主要儀器：CO2恒溫培養箱（371 型，Thermo，美國）；熒光定量PCR 儀（CFX96，Bio?RAD，美國）；高速離心機（5810R，Ep?pendorf，德國）；western?blot 電泳裝置（PowerPacHC，Bio?RAD，美國）；酶標儀（Multiskan Go，Thermo，美國）；激光共聚焦顯微鏡（TCS?SP8 SR，Leica，德國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒提取 根據GenBank 中HIF?1α 的基因序列，參照shRNA 設計原則進行在線分析設計。后為獲取更多質粒，將HIF?1α過表達質粒和篩選出的低表達質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞中，將菌落分別接種于含有卡那霉素和氨芐霉素的SOC 培養基中。依據質粒小體試劑盒的說明書提取質粒，并檢測濃度，用BamHI 內切酶將質粒單切后進行電泳實驗，測試目的條帶，送往吉凱公司進行測序。

1.2.2 細胞分離培養與鑒定 將SD 大鼠采用頸椎脫臼處死法，處死后放入75%（mL/mL）乙醇中浸泡5 min 后分離出股骨與肱骨，剪開骨骺兩端沖出骨髓，充分吹打混勻至懸液后離心。棄上清，管內加入含15%胎牛血清、鏈霉素和青霉素的MEM 完全培養基，分裝至細胞培養瓶內放入培養箱中培養。以后每2～3 d 更換培養基，待細胞匯合度至85%時，用0.25%胰蛋白酶消化1∶2 傳代，細胞傳至第3 代加入熒光抗體上流式細胞儀進行鑒定。

1.2.3 質粒轉染至BMSCs 取第3 代細胞，以密度為5 × 105個/孔接種于6 孔板內，待細胞匯合度達90%左右時，按課題組前期已證實安全有效的轉染劑量，使用Lipofectamine?LTX 轉染試劑將各組質粒分別轉染至BMSCs。轉染后48 h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光表達量，計算轉染率（轉染率＝鏡下熒光細胞數/總細胞數× 100%）。按照轉染質粒的不同將細胞分為過表達實驗組、過表達對照組、低表達實驗組和低表達對照組。

1.2.4 茜素紅染色 BMSCs 轉染48 h 后，換液為成骨誘導液（α?MEM+10% FBS+10 nmol/L β 甘油酸鈉+100 nmol/L 地塞米松+50 μmol/L VitaminC），每3 d 換液一次，成骨誘導3 d 和7 d 后分別進行染色。PBS 洗滌2 遍，4%多聚甲醛固定30 min，ddH2O洗3 遍，1%茜素紅染液染色20～30 min，ddH2O 洗3遍后顯微鏡下觀察鈣結節并拍照。

1.2.5 RT?PCR 檢測相關基因mRNA 用Trizol 法裂解轉染后的各組細胞，提取總RNA，以2 μg 反轉20 μL 體系反轉錄為cDNA，后用RT?PCR 試劑盒檢測成骨分化特異標志物Runt 相關轉錄因子2（Runt?related transcription factor 2，Runx2），以及血管生成特異標志物血小板衍生生長因子?BB（platelet de?rived growth factor?BB，PDGF?BB）、轉化生長因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）的mRNA 表達量。所用引物序列見表1。檢測結果通過公式X＝2?ΔΔCt計算各實驗組目的基因較對照組的相對表達水平。

表1 RT?PCR 引物序列Table 1 Synthetic primers used for RT?PCR

1.2.6 Western blot 檢測相關蛋白 在轉染48 h 后分別提取實驗組和對照組的總蛋白，胰蛋白酶消化后至離心管內，用PBS 洗滌三遍，視細胞量的多少加入RIPA 裂解液，在冰上將細胞充分裂解30 min。后離心（4 ℃，12 000 r，5 min），取上清，加入5 × Loading Buffer 在100 ℃下煮沸10 min。電泳后，轉膜，脫脂奶粉封閉各2 h，一抗稀釋后（GAP?DH 稀釋比例為1∶10 000，HIF?1α、Runx2 和PDGF?BB 稀釋比例為1∶2 000）分別加入，放置搖床，4 ℃孵育過夜。1 × TBST 清洗3 遍，加入二抗室溫下孵育1 h，洗后加入AP 顯色液，使用Image lab version分析上述蛋白結果。

1.3 統計學分析

運用SPSS 24.0 統計軟件分析所得實驗數據，計量資料符合正態性，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義，使用GraphPad Prism 軟件繪制統計圖。

2 結 果

2.1 質粒提取

分別將過表達和低表達組質粒用BamHI 酶切后，過表達實驗組、低表達實驗組的條帶大小分別為：7.8 kb、6.4 kb。與吉凱公司設計結果一致。

2.2 BMSCs 培養和鑒定

原代細胞首次換液后鏡下觀察呈圓形，傳至P3 代可見細胞呈貼壁生長的長梭形、旋渦狀，見圖1。流式細胞術鑒定：間充質干細胞抗原CD29 陽性率為98.2%；表面陰性標記物：造血干細胞抗原CD45 陽性率為4.2%。以上結果均符合間充質來源的干細胞特征。

Figure 1 Cell culture of BMSCs（×50）圖1 BMSCs 的培養（×50）

2.3 細胞轉染率

轉染48 h 后激光共聚焦顯微鏡下可見，成功轉染質粒的BMSCs 呈綠色熒光表達，此時細胞生長密度約75%；低表達實驗組表達量約為76%，對照組約70%；過表達實驗組熒光數量為73%，對照組約68%。見圖2。

Figure 2 BMSC transfected with plasmid after 48 h（×100）圖2 質粒轉染BMSCs 48 h 后（×100）

2.4 茜素紅染色結果

各組成骨誘導3 d 和7 d 后茜素紅染色顯示：低表達實驗組鈣結節面積小于其對照組，也少于同一時間段過表達組的結節數量；過表達實驗組紅色鈣結節面積大于其對照組，隨著成骨誘導時間的增加，各組鈣化面積也增大（圖3）。

Figure 3 BMSC alizarin red staining results for each group（×50）圖3 各組BMSCs 茜素紅染色結果（×50）

2.5 骨分化與血管生成相關因子mRNA 結果

過表達實驗組中HIF?1α 的mRNA 表達量高于其對照組（P＜0.001），低表達實驗組中HIF?1α 的表達減低（P＜0.001）；結果顯示：低表達組中Runx2、PDGF?BB 和TGF?β 的mRNA 表達顯著降低（P＜0.001）；過表達組中Runx2、PDGF?BB 和TGF?β的mRNA 表達水平顯著高于其對照組（P＜0.001），差異均具有統計學意義（表2）。

表2 各組成骨分化與血管生成相關因子mRNA 表達Table 2 mRNA expression of osteogenic differentiation and angiogenesis related factors ±s

表2 各組成骨分化與血管生成相關因子mRNA 表達Table 2 mRNA expression of osteogenic differentiation and angiogenesis related factors ±s

HIF?1α: hypoxia inducible factor?1α; Runx2: runt?related transcription factor 2; PDGF?BB: platelet derived growth factor?BB; TGF?β: transforming growth factor?β

Gene names HIF?1α Runx2 PDGF?BB TGF?β Low expression experimental group 0.373±0.020 0.618±0.012 0.097±0.011 0.447±0.013 Low expression control group 1.023±0.231 1.025±0.229 1.009±0.155 1.023±0.222 t P t P 22.522 32.776 16.531 9.203＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 Over expression experimental group 1.563±0.128 25.462±0.406 3.322±0.111 1.734±0.016 Over expression control group 1.013±0.171 1.023±0.204 1.009±0.147 1.006±0.112 0.896 6.278 1.705 17.389＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.6 骨分化與血管生成相關因子Western blot結果

過表達實驗組中HIF?1α 的蛋白表達高于其對照組（P＜0.001），低表達實驗組中HIF?1α 的表達低于其對照組（P＜0.001）；結果顯示：低表達實驗組中Runx2，PDGF?BB 的表達顯著降低（P＜0.001），過表達實驗組中Runx2，PDGF?BB 的表達顯著增高（P＜0.001），差異具有統計學意義。（圖4）

3 討 論

新骨再生和血管生成是骨組織工程中修復骨缺損的兩個基本環節，研究表明，HIF?1α 途徑的激活可以作為血管生成的關鍵介質，而血管生成正是骨骼再生所必需的［6］。本研究選用HIF?1α 作為細胞因子探討其在組織工程骨中的應用。本實驗茜素紅染色結果顯示，HIF?1α 的表達水平與BM?SCs 鈣結節形成面積成正比，表明了HIF?1α 水平對BMSCs 的成骨能力有重要的影響。

Figure 4 Protein expression of osteogenic differentiation and angiogenesis related factors圖4 各組成骨分化與血管生成相關因子表達

磷脂酰肌醇3?激酶（phosphatidylinositol 3?ki?nase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）作為與HIF?1α 密切相關的信號通路，其傳導途徑是一種原型存活途徑，其中Akt是下游靶標，可在細胞生長或存活中起重要作用。激活后Akt可能通過抗凋亡和促凋亡底物的磷酸化產生抗凋亡作用［7］。其在血管生成中起重要作用，并對正常細胞的增殖、黏附和遷移也起關鍵作用，能夠直接或間接的參與血管生成的全過程。Xie 等［8］研究發現通過受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）激活PI3K/Akt途徑后，可使HIF?1α的表達增強。

轉化生長因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）可誘導血管內皮細胞和血管平滑肌的遷移和分化，既有血管抑制作用也有促血管生成活性，在血管生成中發揮雙重作用［9-10］。TGF?β 可同時調控成骨細胞與破骨細胞間的作用，促進細胞外基質及Ⅰ型膠原的合成，從而參與骨重建。本實驗結果發現，BMSCs 高表達HIF?1α 后，TGF?β 的mRNA 與蛋白表達水平也顯著增高，而HIF?1α 低表達后TGF?β 的mRNA 與蛋白表達水平顯著降低。Lv 等［11］將HIF?1α 干擾RNA 質粒轉染至小鼠NIH?3T3 細胞以沉默內源性HIF?1α，結果顯示沉默HIF?1α 后細胞中TGF?β 的表達沒有增加。

PDGF?BB 為一種貯藏在血小板內的堿性蛋白質，是間充質細胞遷移和增殖的關鍵調節因子［12］，通過在血管周圍細胞發揮作用從而促進血管的成熟。本實驗結果顯示，BMSCs過表達HIF?1α后顯示PDGF?BB 的mRNA 和蛋白表達均增加。Pang 等［13］在研究中發現PI3K/Akt 信號通路參與了PDGF?BB誘導的氣道平滑肌細胞增殖與遷移。Mermis 等［14］將HIF?1α 特異性siRNA 敲低，結果顯示HIF?1α 轉染細胞PDGF?BB 在艾滋病病毒GP?120 蛋白的存在下的表達顯著降低，與本實驗結果一致。

Runx2 作為HIF?1α 直接靶點，能夠將間充質干細胞、成骨細胞和前成骨細胞中的相關成骨基因進行定向轉錄和翻譯，可用于檢測成骨分化的能力［15］。有報道指出HIF?1α 上調可以增強Runx2 的表達，Runx2 參與體內成骨過程［16］；Qu 等［17］發現沉默HIF?1α 的表達后可顯著抑制Runx2 的表達。本實驗結果顯示分別上調和下調BMSCs 中的HIF?1α后，Runx2 的mRNA 和蛋白表達水平分別呈上升和下降趨勢，這與Xu［16］的研究結果一致。

綜上所述，HIF?1α 作為促進成骨分化及血管生成能力的重要因子，通過調控Runx2、PDGF?BB、TGF?β 的水平影響BMSCs 的成骨分化及血管生成能力。

【Author contributions】Zuo XH performed the experiments and wrote the article. Li J processed and analyzed the data. Han XZ re?vised the article. Liu XY performed the experiments. He HY de?signed the study and reviewed the article. All authors read and ap?proved the final manuscript as submitted.