富血小板纖維蛋白與脫細胞真皮基質修復兔口腔黏膜缺損效果比較

王承煜， 范亞偉， 王玨

1.山西醫科大學口腔醫學院·口腔醫院，山西 太原（030000）； 2.山西醫科大學第一醫院口腔科，山西 太原（030000）

隨著對口腔種植技術的深入研究，研究者發現當種植術區具有充足的軟組織量時才能保證良好的生物學封閉，減少種植體周圍炎的發生［1］。目前，修復口腔黏膜缺損的方法有很多，然而判斷軟組織增量效果的金標準仍然是自體結締組織移植［2］，但其創傷較大、易發生感染且需要開辟第二術區，不易被患者接受。隨著生物科技的進步和發展，生物膜性材料逐步發展并成為臨床中常用的軟組織修復材料，其中富血小板纖維蛋白（plate?let rich fibrin，PRF）和脫細胞真皮基質（acellular dermal matrix，ADM）在臨床上應用較多，但目前兩種修復材料增量技術比較相關研究較少［3］。本實驗主要探討PRF 和ADM 對口腔黏膜缺損的修復效果，為生物膜性材料在口腔種植中的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3 月齡健康雄性日本大耳白兔36 只，體重2.74～3.08 kg，由太原市小店區豐澤園種養農民專業合作社提供，實驗動物生產許可證號SCXK（晉）2015?0003。

1.2 實驗分組

隨機將實驗動物分為4 組，每組9 只；分別為PRF 組，ADM 組，Autograft 組（自體結締組織移植組）及Control 組（空白對照組）。本研究已獲得山西醫科大學倫理委員會批準。

1.3 PRF 及ADM 的獲取

對PRF 組9 只兔子在耳中動脈處連接真空采血管，采血量為5 mL，以3 000 rpm 轉速離心10 min。靜置后，取出并修剪PRF 凝膠，最后用紗布擠壓法除去PRF 凝膠中的水分，塑形成PRF 膜。ADM 組采用吉特瑞?醫用膠原修復膜，修剪為直徑10 mm 的圓形膜。

1.4 制備10 mm 黏膜缺損模型以及缺損平均厚度的測定

術前8 h 對實驗動物禁飲食，使用苯巴比妥鈉（100 mg/kg）經腹腔注射實施麻醉，待麻醉后固定于兔臺。1%碘伏消毒，鋪單，拉開口角，暴露硬腭。在距上頜門齒8 mm 的硬腭區中央位置，用直徑為10 mm 環形切取器制備黏膜缺損，去除黏骨膜瓣形成圓形缺損區（圖1a），暴露骨面。PRF 組用4?0 絲線將對應的PRF 間斷縫合于各自的黏膜缺損處；ADM 組用4?0 絲線將直徑10 mm 的ADM間斷縫合于各自的黏膜缺損處；Autograft 組在術區后方2.5 mm 處開辟第二術區，用10 mm 環形切取器取結締組織瓣，修剪后間斷縫合于各自的黏膜缺損處，第二術區紗布壓迫30 min 止血；Control 組黏膜缺損處使用紗布壓迫30 min 止血。術前1 h和術后連續3 d 肌肉注射青霉素鈉（100 000 U/kg），1 次/d，預防感染。游標卡尺測量在建模時切取下的硬腭黏膜中心及外側，取平均值作為各組的硬腭黏膜厚度（圖1b）。

Figure 1 Preparation of 10 mm mucosal defect model and measurement of mucosal defect thickness圖1 制備10 mm 黏膜缺損模型及測量黏膜缺損厚度

1.5 效果評價

1.5.1 創面愈合率的測定 術后7、14、21 d 將四組的實驗兔麻醉后肉眼觀察創面愈合情況并拍照記錄。觀察完畢后各組隨機處死3 只，利用牙周探針給定標準長度，單反相機垂直與組織創面進行拍攝。ImagePlus 6.0 軟件測量愈合率。R＝（S初-S末）÷S初。R 為愈合率，S初為初始創面面積，S末為未愈合的創面面積。創面愈合區組織標本行石蠟包埋切片。

1.5.2 炎癥等級的評分 在100 倍及400 倍顯微鏡下觀察各組織HE 切片組織，并給予炎癥等級評分測定。0 分：無炎癥，或有散在炎細胞；1 分：少量（＜30%）炎細胞浸潤；2 分：介于1 和3 分之間；3 分：大量（＞60%）炎細胞浸潤。具體評分標準見表1。

表1 炎癥分級評分標準［4］Table 1 Inflammation grading score criteria［4］

1.5.3 上皮平均厚度測定 在100 倍顯微鏡下采集各組織HE 切片組織的5 幅圖像。每張圖像在10 個不同部位用Imageplus6.0 軟件測量上皮厚度，得到平均值。

1.6 統計學方法

用SPSS 24.0 軟件，對所有檢測指標進行統計分析。計數資料用頻數表示，計量資料用均數±標準差表示。炎癥等級評分采用Kruskal?Wallis 檢驗和Mann?Whitney U 檢驗；愈合率、上皮平均厚度采用單因素方差分析和析因設計方差分析；若總體方差齊，用Bonferroni 檢驗進行組間兩兩比較；若總體方差不齊，則采用Games?Howell 檢驗。檢驗水準為α＝0.05。

2 結 果

2.1 黏膜缺損平均厚度

PRF 組黏膜缺損平均厚度為（2.28±0.29）mm，ADM 組為（2.21 ± 0.53）mm，Autograft 組為（2.18 ±0.16）mm，Control 組為（2.26 ± 0.20）mm；經SNK 檢驗，F＝0.13，P＝0.93，各組黏膜缺損平均厚度差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，可以進行后續實驗。

2.2 創面愈合率

經Bonferroni 校正的多重比較結果顯示：①PRF 組、ADM 組與Autograft 組各時間點的創面愈合率均高于Control 組，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；②PRF 組與ADM 組在各時間點的創面愈合率比較無顯著差異（P＞0.05）；③PRF 組、ADM 組在各時間點的創面愈合率均低于Autograft 組，差異均具有統計學意義（PRF 組：P7d＜0.001，P14d＜0.001，P21d＜0.001；ADM 組：P7d＜0.001，P14d＜0.001，P21d＜0.001）。見表2、圖2。

2.3 HE 染色結果

將建模時切取的硬腭黏膜做HE 染色，能在顯微鏡下看到硬腭黏膜的全部組織結構，可以認為缺損處無黏骨膜附著，完整切取了硬腭黏骨膜，可以進行后續實驗。

表2 各組創面愈合率比較Table 2 Comparison of wound healing rate in each group±s，n=3

表2 各組創面愈合率比較Table 2 Comparison of wound healing rate in each group±s，n=3

#：compared with Control group，P ＜0.05；*：compared with Autograft group，P ＜0.05；△：compared with ADM group，P ＜0.05；PRF：platelet rich fibrin；ADM：acellular dermal matrix；Autograft：autolo?gous connective tissue transplantation;Control:blank control

Group PRF ADM Autograft Control FP Wound healing rate（%）7 d 66.13±2.36#*64.43±2.85*#89.06±3.80#△29.63±2.31 215.047＜0.001 14 d 87.63±2.20#*86.56±1.13*#99.16±0.76#△65.23±2.90 158.569＜0.001 21 d 97.06±0.73#*95.40±1.21*#99.83±0.28#△89.03±1.38 62.636＜0.001

術后7 d：Control 組可見組織內大量炎性細胞浸潤，組織結構紊亂，新生血管較少；其余三組細胞開始修復，可見結締組織增值，可見新生毛細血管，炎性細胞數量較Control 組少；ADM 組結締組織排列更為規則、致密（與ADM 本身的結締組織網狀結構有關系）；Autograft 仍有上皮釘突存在。術后14 d：Control 組上皮開始修復，但多處組織仍有大量炎性細胞浸潤；Autograft 組上皮呈現完整連續狀態；PRF 組與ADM 組仍有新生肉芽組織向表面生長，上皮不完全連續，且ADM 組上皮與PRF 組相比較厚。術后21 d：Control 組炎癥減輕，其余三組上皮完整，且厚度基本一致。見圖3。

Figure 2 Wound healing of hard palate mucosal defects in each group圖2 各組硬腭黏膜缺損術后創面愈合情況

2.4 炎癥等級評分

Bonferroni 校正的Mann?Whitney U 檢驗結果顯示，①PRF 組、ADM 組、Autograft 組分別與Control 組在術后各時間點的炎癥等級評分比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；②PRF 組、ADM 組與Auto?graft 組在術后各時間點的炎癥等級評分兩兩之間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 上皮厚度

Figure 3 HE staining of hard palate mucosa in each group after operation圖3 各組硬腭黏膜術后HE 染色

表3 各組炎癥等級評分Table 3 Inflammation grade score of each group n=3

經Bonferroni 校正的多重比較結果顯示：①PRF 組、ADM 組與Autograft 組在術后各時間點的上皮厚度均比Control 組高（P＜0.05）；②ADM 組在術后7、14 d 的上皮厚度比PRF 組高，差異均具有統計學意義（P7d＜0.001，P14d＜0.001）；③ADM 組在術后各時間點的上皮厚度與Autograft 組相比無顯著差異（P＞0.05）；④PRF 組在術后7、14 d 的上皮厚度均低于Autograft 組，差異具有統計學意義（P7d＜0.001，P14d＜0.001）。見表4。

表4 各組術后上皮厚度比較Table 4 Comparison of postoperative epithelial thickness in each group ±s，n=3

表4 各組術后上皮厚度比較Table 4 Comparison of postoperative epithelial thickness in each group ±s，n=3

#：compared with Control group，P ＜0.05；*：compared with Auto?graft group，P ＜0.05；△：compared with ADM group，P ＜0.05；PRF：platelet rich fibrin；ADM：acellular dermal matrix；Autograft：autologous connective tissue transplantation;Control:blank control

Group PRF ADM Autograft Control FP Epithelial thickness（μm）7 d 129.33±17.84#*△189.77±7.13#192.60±10.93#0 154.58＜0.001 14 d 221.20±18.31#*△292.10±20.09#316.30±21.51#129.37±14.43 59.96＜0.001 21 d 278.13±8.29#280.67±6.45#291.33±1.65#232.07±10.00 38.68＜0.001

3 討 論

本實驗選擇兔作為實驗對象，主要考慮以下原因：①兔硬腭咀嚼黏膜相對充足，且組織學結構與人的口腔黏膜類似；②對于兔來說10 mL 采血量被認為是安全可行的，滿足本次實驗制備PRF 的采血要求。對實驗動物制備軟組織缺損目前國內外無明確統一的標準。本實驗應用10 mm 的標準化器械，可認為是具有科學性、重復性、可靠性、標準化口腔軟組織缺損動物模型，符合實驗的條件，可以保證實驗的順利進行［5］。

PRF 是以富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）為基礎研制的新一代血小板濃縮制品，是自體全血離心的產物，被認為是一種自體移植物［6］。收集自體血立即3 000 rpm 離心10 min，可得到去血小板血漿、PRF 凝膠和紅細胞碎片，其分別位于離心管的上、中、下層；制備過程不添加抗凝劑和外部化學物質。PRF 疏松的結構能夠容納大量的血小板及生長因子，如血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉化生長因子（transforming growth factor?β，TGF?β）和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等。在這些生長因子的作用下，軟組織愈合和成熟的三個關鍵步驟（血管生成、免疫和上皮覆蓋）可以被同時支持，從而大大加快軟組織的愈合［7］，因PRF 的以上特性，其被應用于眾多領域中。在外科手術中，PRF 的應用可加速愈合，減少不良反應并改善預后［8］。PRF 被證實可以促進成纖維細胞增殖和創面愈合［9］。在口腔醫學中，PRF 已被證實能夠促進牙齦成纖維細胞的黏附、遷移及增殖，還能在愈合過程中高效地表達I 型膠原蛋白［10］。近些年來，隨著對PRF 制備流程的改良，又成功制取出了i?PRF（injectable platelet rich fibrin，i?PRF）等基于PRF 的衍生物，其可以更加有效且長期的釋放生長因子，進一步加快了軟組織的愈合［11］。

ADM 是通過特殊處理，去除了所有細胞成分的一種組織移植物。由于這些機械加工的生物支架能快速結合到生物組織中，因此被廣泛應用于各種外科手術中，且已被提議作為治療口腔黏膜創傷的一種方法。ADM 處理過程為去除含角蛋白的表皮后，處理真皮層以去除所有的脫氧核糖核酸，而不破壞膠原基質，故ADM 具有充分的空間供宿主細胞浸潤、促進新生血管形成和加速上皮形成［12］。Xu 等［13］的動物實驗結果顯示ADM 對于兔硬腭軟組織缺損可刺激輕微的炎癥反應，表現出快速的上皮化和血管重建，并伴有VEGF 和葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter type 1，GLUT1）的增加，促進缺損部位的組織生長。無論是在牙周整形或是口腔種植手術中，ADM 都顯示出了與結締組織移植物（connective tissue graft，CTG）相當的牙齦退縮減少和軟組織厚度增加，而且能獲得與CTG 相同的舒適度［14］。目前國外對ADM 的使用較為廣泛，應用于眾多領域，如外科、乳腺外科、燒傷整形科等；在口腔治療中應用于頜面外科、牙周科、口腔種植科等。然而在國內，ADM 仍未被廣泛使用，在口腔治療中僅被應用于牙周手術，充當上皮下結締組織瓣［15］。

在本實驗中，筆者比較了ADM、PRF 和自體結締組織移植物對黏膜缺損的修復效果，結果顯示，與PRF 相比，ADM 在術后2 周以內的上皮厚度增量方面更具有優勢，但在3 周后，PRF 與ADM 的上皮厚度增量效果無顯著差異。ADM 對上皮厚度增量的影響主要涉及以下機制：①ADM 具有的纖維三維網狀結構，能夠起調節、誘導、促進作用，為宿主成纖維細胞、血管內皮細胞等的和增生提供網狀空間，局部形成新生血管和上皮，容納并支撐細胞的生長；②PRF 降解期為2～3 周，而ADM 在體內可存在數月，更有利于萎縮組織的再生，更適合應用于牙周科對于牙齦退縮的治療；③ADM 可以和人體結締組織實現整合，有利于ADM 的固定。

本實驗結果顯示，ADM 可以獲得與CTG 接近的軟組織增量效果。但是ADM 仍然存在不足之處：①雖然有證據表明ADM 移植可以取得與CTG相似的結果［16］，但是最近的一項長達15 年的臨床研究結果顯示，盡管ADM 長期的美學效果較優，但效果并不如結締組織移植物穩定，存在少量的組織萎縮［17］；②在創面愈合初期，ADM 組與血液提取物組相比CD68 陽性細胞較少，且CD31 染色顯示創口邊緣處新生血管較少［18］；③ADM 組與宿主自生的結締組織仍有差異，在ADM 內可觀察到毛細血管和小血管［19］；④ADM 很難完全去除所有細胞殘余物。隨著技術的不斷改善，新的方法不斷應用到ADM 的制備中，ADM 的安全性在不斷提高，但其仍有疾病傳播的理論風險，這是所有異體移植制劑都存在的問題。

【Author contributions】Wang CY performed the experiments and wrote the article. Fan YW designed the study and reviewed the article.Wang J directed the data collection and analysis. All authors read and approved the final manuscript as submitted.