中晚期骨關節(jié)炎患者軟骨細胞自噬相關因子表達變化及雷帕霉素對其軟骨細胞自噬的影響

王浩，陳群超，殷麗麗

蘇州市立醫(yī)院 蘇州市區(qū)域性骨質(zhì)疏松指導中心，江蘇蘇州215000

在骨關節(jié)炎（OA）發(fā)展過程中，軟骨細胞中受損的細胞器和降解的大分子物質(zhì)逐漸積累，導致軟骨細胞內(nèi)細胞合成、分解代謝失衡，軟骨細胞功能異常、生存能力下降，細胞外基質(zhì)合成能力下降，從而加速了軟骨細胞退變［1-2］。自噬是一種細胞自我降解并回收細胞內(nèi)組分的過程，在維持細胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)和提高細胞存活率方面具有重要作用［3］。在哺乳動物細胞自噬中，與ULK1、Beclin1 和LC3 自噬相關的基因分別發(fā)揮誘導、調(diào)節(jié)、執(zhí)行的作用［4］。哺乳動物中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）可負調(diào)節(jié)自噬過程，在軟骨細胞自噬的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［5］。雷帕霉素可以抑制mTOR 信號通路的mTOR 復合物1（mTORC1）表達［6］，其是否可以誘導軟骨細胞的自噬水平鮮見報道。2018 年 5 月—2020 年 5 月，本研究比較了中晚期OA 患者軟骨細胞自噬相關因子的表達變化，并觀察雷帕霉素對中晚期OA 患者軟骨細胞自噬的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 藥物：雷帕霉素購自北京索萊寶科技有限公司。主要試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶溶液、Ⅱ型膠原酶均購自美國 Hycolon 公司，TRIzol 試劑、Taq PCR 反應試劑盒均購自中國大連寶生物公司，dNTP Promega、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自加拿大Fermentas 公司；抗ULK1、抗Beclin1、抗LC3均購自英國Abcam公司。引物：自噬相關基因 ULK1、Beclin1、LC3 及內(nèi)參 β-actin 引物均由上海生工生物工程有限公司設計合成。

1.2 標本獲取及分組 根據(jù)Kellgren and Lawrence影像學診斷標準，選擇我院截肢手術或膝關節(jié)置換術中獲得的膝關節(jié)正常軟骨標本5 例份（正常對照組）、中期OA 軟骨標本10 例份（中期OA 組）、晚期OA 軟骨標本10 例份（晚期OA 組）。排除既往有膝關節(jié)感染性疾病和明顯關節(jié)外傷患者、多類型關節(jié)炎（繼發(fā)性骨關節(jié)炎、痛風性關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎）患者的膝關節(jié)軟骨標本。本研究通過南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.3 軟骨細胞分離與培養(yǎng) 取各組軟骨標本，生理鹽水反復沖洗，轉(zhuǎn)移至盛有DMEM 培養(yǎng)基的離心管中，在低溫條件下盡快轉(zhuǎn)運至實驗室進行細胞分離。在無菌的50 mL 離心管中放入適量軟骨組織，加入少量培養(yǎng)基直至樣品浸沒；將小于1 mm3的小塊軟骨用無菌生理鹽水清洗并干燥，加入0.25%胰蛋白酶消化并離心（1 000 r/min，離心半徑6 cm，離心3 min），加入0.2%膠原酶溶液，37 ℃水浴中搖動并消化；使用無菌200 目不銹鋼無菌濾網(wǎng)過濾并離心（1 000 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min），用無菌生理鹽水懸浮沉淀細胞，并重復離心1次（1 000 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min）。將沉淀細胞懸浮于20% FBS 培養(yǎng)基中，以（0.5～2）×105/mL 接種在燒杯或培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，按時更換培養(yǎng)液。

1.4 軟骨細胞 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取各組軟骨細胞，采用TRIzol 法提取總RNA，通過核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測總RNA 純度以及RNA 片段的完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR 試劑盒進行檢測。PCR反應體系30μL：10×buffer（Mg2+free）3 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP（25 mmol/L）0.36 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，探針0.6 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 18.74 μL，cDNA 2 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性 2 min，95 ℃變性 20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共循環(huán) 30 次。以 β-actin 為內(nèi)參，采用 2－ΔΔCt法計算各組ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 相對表達量，其引物序列、擴增長度見表1。

表1 ULK1、Beclin1、LC3及β-actin的引物序列及擴增長度

1.5 軟骨細胞ULK1、Beclin1、LC3 蛋白表達檢測采用Western blotting法。取各組軟骨細胞，使用預冷的蛋白提取液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移后迅速去膜，并在TBST溶液中洗滌3 min，封閉1 h；加入 ULK1、Beclin1、LC3 一抗（稀釋比例均為1∶500），室溫條件下孵育2 h，TBST洗滌；加入二抗（稀釋比例均為1∶500），室溫條件下孵育2 h，TBST洗滌。ECL顯色劑曝光、顯影，采用Quantity One凝膠圖像分析軟件測定目標蛋白條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值，計算目標蛋白相對表達量。

1.6 雷帕霉素對各組軟骨細胞ULK1、Beclin1、LC3表達影響的觀察

1.6.1 雷帕霉素處理 取各組傳至2 代的軟骨細胞，以1×105/孔接種到6 孔板中，孔板中添加適量低糖DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達30%～40%時，分別向細胞中加入等體積無血清培養(yǎng)基（記做0 μmol/L 雷帕霉素）及1、5、10μmol/L雷帕霉素。

1.6.2 雷帕霉素處理后軟骨細胞ULK1、Beclin1、LC3表達檢測 各組細胞經(jīng)雷帕霉素處理后，將孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；6 h后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入2 mL含10%FBS的新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。參照1.4 采用實時熒光定量PCR 法檢測細胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA表達，參照1.5采用Western blotting法檢測細胞ULK1、Beclin1、LC3蛋白表達。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以-x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗和配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達比較 見表1。

表1 各組細胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達比較（±s）

表1 各組細胞ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與中期OA組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組中期OA組晚期OA組ULK1 mRNA 0.001 3±0.000 4 0.000 6±0.000 2*0.000 2±0.000 1*#蛋白0.297 0±0.018 3 0.093 3±0.005 0*0.029 0±0.001 0*#Beclin1 mRNA 0.019 6±0.007 1 0.008 4±0.001 9*0.002 6±0.000 9*#蛋白0.947 0±0.007 0 0.853 7±0.011 7*0.376 3±0.003 5*#LC3 mRNA 0.003 7±0.001 0 0.001 3±0.000 3*0.000 7±0.000 2*#蛋白0.574 7±0.002 3 0.324 0±0.007 9*0.068 7±0.002 5*#

2.2 各組細胞經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后ULK1、 Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達比較 見表2。

表2 各組細胞經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達比較（±s）

表2 各組細胞經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表達比較（±s）

注：與同組加入0μmol/L雷帕霉素比較，*P＜0.05；與正常對照組加入同濃度雷帕霉素比較，#P＜0.05；與中期OA組加入同濃度雷帕霉素比較，△P＜0.05。

組別正常對照組0μmol/L雷帕霉素1μmol/L雷帕霉素5μmol/L雷帕霉素10μmol/L雷帕霉素中期OA組0μmol/L雷帕霉素1μmol/L雷帕霉素5μmol/L雷帕霉素10μmol/L雷帕霉素晚期OA組0μmol/L雷帕霉素1μmol/L雷帕霉素5μmol/L雷帕霉素10μmol/L雷帕霉素ULK1 mRNA 0.001 3±0.000 4 0.001 8±0.000 5 0.002 9±0.000 6*0.003 2±0.000 6*0.000 6±0.000 2#0.001 1±0.000 3#0.002 1±0.001 1*0.002 9±0.000 9*0.000 2±0.000 1#△0.000 3±0.000 1#△0.000 4±0.000 2#△0.000 8±0.000 3*#△蛋白0.361 0±0.002 6 0.545 0±0.031 7*0.804 3±0.036 2*0.899 0±0.041 6*0.279 3±0.015 3#0.597 3±0.009 6*0.647 7±0.030 9*#1.028 0±0.035 9*#0.050 0±0.004 4#△0.075 0±0.006 1#△0.132 7 ± 0.022 7*#△0.201 0 ± 0.032 7*#△Beclin1 mRNA 0.019 6±0.007 1 0.024 1±0.006 1 0.039 9±0.006 7*0.042 9±0.011 5*0.008 0±0.001 6#0.012 6±0.002 4#0.020 7±0.006 9*#0.026 7±0.005 0*#0.002 7±0.000 7#△0.003 2±0.000 8#△0.003 9±0.001 4#△0.005 4±0.000 8*#△蛋白0.537 3±0.031 0 0.779 3±0.063 7*0.945 3±0.058 9*0.999 3±0.043 5*0.463 7±0.014 2#0.887 3±0.014 4*#0.932 0±0.023 0*1.016 7±0.038 0*0.190 0±0.004 4#△0.230 7±0.008 4#△0.290 0±0.021 5#△0.484 7±0.105 1*#△LC3 mRNA 0.003 7±0.001 0 0.004 8±0.000 8 0.007 7±0.001 9*0.008 4±0.001 0*0.001 3±0.000 3#0.002 2±0.000 5#0.003 9±0.000 9*#0.005 4±0.001 4*#0.000 7±0.000 2#△0.000 9±0.000 3#△0.001 3±0.000 4#△0.002 2± 0.001 0*#△蛋白0.625 3±0.025 6 0.750 7±0.032 5*0.954 0±0.047 7*1.061 3±0.040 6*0.372 3±0.023 0#0.730 3±0.046 6*0.931 7±0.008 4*1.110 7±0.178 0*0.164 7±0.023 1#△0.202 7±0.014 2#△0.225 0±0.020 8#△0.538 0 ± 0.065 2*#△

3 討論

OA 是一種退行性疾病，會影響包括軟骨、軟骨下骨和滑膜在內(nèi)的整個關節(jié)，最終使關節(jié)軟骨發(fā)生退行性改變［7］。關節(jié)軟骨由少量的軟骨細胞和豐富的細胞外基質(zhì)構成，軟骨細胞的正常功能狀態(tài)在維持代謝穩(wěn)態(tài)和細胞外基質(zhì)的結構完整性中具有重要作用［8］。因此，軟骨細胞在關節(jié)軟骨的發(fā)育形成、退變中扮演重要角色。自噬可以不斷降解自身細胞器和受損的大分子物質(zhì)，因此是細胞自我保護的機制之一。自噬在軟骨細胞的成熟和穩(wěn)態(tài)中也具有重要作用。本研究結果發(fā)現(xiàn)，中期OA 組、晚期OA 組細胞 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白相對表達量均低于正常對照組，且晚期OA 組降低更明顯；說明隨著OA 的進展，軟骨細胞自噬相關基因ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達逐漸降低；提示自噬是軟骨細胞的保護機制，當軟骨細胞受損后，自噬水平被抑制，進一步加速了OA 的進程。這與CAR?AMéS等［9］、LOTZ等［10］的研究結果一致。

雷帕霉素是臨床上常用的自噬誘導劑。CAR?AMéS 等［9］使用雷帕霉素體外處理軟骨機械損傷模型，發(fā)現(xiàn)其自噬相關基因蛋白表達顯著增加，軟骨細胞凋亡和蛋白聚糖損失顯著減少。雷帕霉素可能通過調(diào)節(jié)mTOR 信號通路，參與細胞自噬和減慢軟骨細胞變性。但OA 是由體內(nèi)和體外多種因素引起的，僅基于實驗室獲得的軟骨模型可能無法真正替代人類的OA 軟骨。因此，本研究使用雷帕霉素干預人OA 軟骨細胞。由于早期OA 軟骨標本獲取困難，本研究僅觀察了中晚期OA 軟骨細胞的自噬水平。結果顯示，與同組加入0μmol/L 雷帕霉素處理后比較，正常對照組、中期 OA 組經(jīng) 5、10 μmol/L 雷帕霉素處理后 ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達均升高，晚期OA 組經(jīng)10μmol/L 雷帕霉素處理后ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達均升高；說明雷帕霉素可促進正常軟骨細胞及中晚期OA 患者軟骨細胞的自噬過程。本研究結果顯示，與經(jīng)相同濃度雷帕霉素處理后的中期OA 組比較，晚期OA 組ULK1、Beclin1、LC3 mRNA 及蛋白表達均降低；說明雷帕霉素在中期OA 軟骨細胞中具有更強的自噬誘導作用，而對于晚期OA 軟骨細胞的自噬誘導作用明顯減弱。分析原因，OA 軟骨細胞自噬受到抑制，可預防性地發(fā)生細胞凋亡，晚期OA 軟骨細胞降解、功能異常、自噬過程受阻更明顯，因此雷帕霉素調(diào)節(jié)晚期OA軟骨細胞自噬的作用受到限制［11-12］。

CHANG 等［13］研究顯示，在正常氧含量條件下，自噬誘導劑雷帕霉素可上調(diào)正常軟骨細胞自噬，降低細胞凋亡率；而在低氧條件下，自噬抑制劑3-MA可下調(diào)OA 軟骨細胞自噬，降低細胞凋亡率；提示上調(diào)正常軟骨細胞自噬水平能促進軟骨細胞生存，而上調(diào)OA 軟骨細胞自噬則促進軟骨細胞凋亡。而CARAMéS 等［9］及 SASAKI 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可上調(diào)OA 軟骨細胞自噬，降低細胞凋亡率。這些結果之間的差異表明，某些外部因素能夠調(diào)節(jié)自噬對細胞增殖活性的影響。IGLEWSKI 等［14］研究表明，自噬對細胞存活的影響取決于細胞外刺激的類型。當細胞暴露于DNA 損傷劑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和放射性環(huán)境中時，自噬活性增強有助于細胞存活；而當細胞處于低氧、砒霜作用等環(huán)境中時，自噬活動增強則促進細胞凋亡。因此，雷帕霉素調(diào)節(jié)軟骨細胞自噬從而影響細胞凋亡的具體機制仍有待進一步研究。