過表達sFRP2 基因對脂多糖誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響及其分子機制

蒙艷，白漪，霍松

昆明醫科大學附屬紅河醫院，云南紅河661000

血管內皮細胞（VECs）存在于血管內層，是抗血栓形成和抗炎的重要屏障，在維持血管穩態、調節血管運動和參與生命活動中發揮重要作用［1］。內皮細胞功能障礙可導致血管損傷，血管穩態失衡，最終導致動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等血管疾病的發生［2］。分泌型卷曲相關蛋白2（sFRP2）具有Wnt拮抗劑的作用，是一種分泌型的抗凋亡相關蛋白［3］。研究顯示，在心臟成纖維細胞中sFRP2 可激活Wnt/β-catenin信號通路，減輕心肌纖維化，從而改善心臟功能［4］。在血管生成模型中，sFRP2 可抑制缺氧誘導的內皮細胞凋亡，增加內皮細胞遷移，從而誘導血管形成［5］。最近研究顯示，脂多糖（LPS）可刺激人支氣管上皮細胞中Wnt5a、β-catenin 表達升高，且Wnt抑制劑能抑制LPS 刺激引起的炎癥反應［6］。目前，LPS 誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）凋亡已被廣泛用于研究內皮細胞凋亡的體外實驗模型，但是sFRP2 對LPS 誘導HUVECs 凋亡的影響及其相關機制報道較少。為此，我們于2018 年5 月—2020 年1月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：HUVECs 購自武漢普諾賽生命科技有限公司。質粒：sFRP2 過表達及陰性對照慢病毒質粒由上海吉凱基因科技有限公司構建及包裝。主要試劑：TRIzol 試劑購自美國Thermo 公司，逆轉錄試劑盒購自北京寶日醫生物技術有限公司，qPCR試劑盒購自上海東洋紡生物科技有限公司；兔抗sFRP2、兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗Wnt1 均購自美國Abcam 公司，兔抗 Cyt C、兔抗 β-catenin 及 Cyclin D1均購自美國CST 公司，β-actin 購自武漢三鷹生物技術有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；細胞裂解液和蛋白酶抑制劑均購自上海碧云天生物技術有限公司，BCA 試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。

1.2 LPS 作用濃度篩選 采用CCK-8 法。將HU?VECs 置于含 10%FBS 的 DMEM 高糖培養基，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。調整HUVECs 細胞密度為5×105/mL，取100 μL 接種于96 孔培養板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，培養 24 h。將 HUVECs 分為兩部分，一部分加入不同濃度 LPS（0、5、10、15、20μg/mL），另一部分作為對照細胞不予特殊處理，作用12 h。吸出原培養液，每孔加入新鮮培養液100 μL 和CCK-8 溶液10 μL，培養箱中孵育3 h。使用酶標儀讀取490 nm處的光密度（OD）值，每次實驗設置 3 個復孔。細胞存活指數=（OD待測孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）。結果顯示，加入 0、5、10、15、20μg/mL LPS 作用 12 h 的 HUVECs 細胞存活指數分別為 0.78 ± 0.10、0.91 ± 0.05、0.66 ± 0.12、0.43 ±0.04、0.28 ± 0.03，對照細胞為1.08± 0.07；加入10、15、20μg/mL LPS作用12 h的HUVECs細胞存活指數明顯低于對照細胞（P均＜0.01），選擇10μg/mL LPS作用12 h作為后續實驗條件。

1.3 細胞分組及處理 取融合至70%～80%的HUVECs，以 1×106/孔接種至 6 孔板中，細胞貼壁18～24 h后分為過表達組和陰性對照組。過表達組和陰性對照組分別轉染sFRP2過表達及陰性對照慢病毒質粒，轉染48 h后加入10μg/mL LPS作用12 h。

1.4 細胞sFRP2 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取兩組細胞，用冰冷的PBS 離心洗滌后去除上清，向沉淀中加入1 mL TRIzol 裂解液，提取細胞總RNA，測定RNA 濃度及純度合格后，將RNA逆轉為cDNA。以cDNA 作為模板，加入酶和引物進行PCR 反應，每個樣本獨立重復檢測3次，每次設置3 個復孔。sFRP2 引物序列：上游引物5'-GAC?CATTTCTGCTCCGGGAT-3'，下游引物 5'-GGGGAT?GCAAACGTGCAAAA-3'。內參GAPDH 引物序列：上游引物5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。采用2－ΔΔCt法計算sFRP2 mRNA相對表達量。

1.5 細胞sFRP2蛋白表達檢測 采用Western blot?ting 法。取兩組細胞，用冰冷的PBS 離心后冰上裂解20 min，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。加入適量上樣緩沖液，金屬浴100 ℃煮沸5 min 使蛋白變性。定量40 μg 總蛋白，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，電泳結束后將蛋白轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h 以上。分別加入sFRP2（1∶1 000）和內參β-actin（1∶3 000）一抗，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1.5 h。TBST 洗膜，滴加ECL 化學發光底物，化學發光成像儀顯影拍照。以β-actin為內參，采用Image J軟件分析條帶灰度值，計算sFRP2蛋白相對表達量。

1.6 細胞凋亡能力觀察 采用流式細胞術。取兩組細胞，用不含EDTA 的胰酶消化，預冷PBS 洗滌2次；1 500 r/min 離心 5 min，收集沉淀，加入 500 μL緩沖液重懸細胞，制成密度為5×108/L 的細胞懸液。分別加入5μL Annexin Ⅴ（綠色熒光）和PI（紅色熒光）染液，混勻后避光孵育15 min。使用流式細胞儀計算細胞凋亡率。

1.7 細胞凋亡相關蛋白及Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達檢測 取兩組細胞，參照1.5采用Western blot?ting法檢測凋亡相關蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl-2及Wnt/β-catenin 通路相關蛋白Cyclin D1、β-catenin（以上稀釋比例均為1∶1 000）、Wnt1（稀釋比例為1∶4 000）表達，β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用Graphpad7.0 和SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞sFRP2 表達比較 過表達組與陰性對照組sFRP2 mRNA 相對表達量分別為2.69 ±0.13、1.04 ± 0.21，蛋白相對表達量分別為 3.89 ±0.18、1.05± 0.24；兩組比較P均＜0.01。見圖1。

圖1 兩組細胞sFRP2蛋白表達條帶圖（Western boltting法）

2.2 兩組細胞凋亡率比較 過表達組與陰性對照組細胞凋亡率分別為13.32% ± 1.98%、20.90% ±1.72%，兩組比較P＜0.01。

2.3 兩組細胞凋亡相關蛋白及Wnt/β-catenin 通路相關蛋白表達比較 過表達組Cleaved Caspase-3、Bax及Wnt1、β-catenin、Cyclin D1表達均低于陰性對照組，Bcl-2表達高于陰性對照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組細胞凋亡相關蛋白及Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達比較（±s）

表1 兩組細胞凋亡相關蛋白及Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達比較（±s）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05。

組別過表達組陰性對照組Bax 2.14±0.03*4.13±0.03 Cleaved Caspase-3 2.66±0.04*3.24±0.06 Bcl-2 0.67±0.10*0.38±0.04 Wnt1 1.70±0.07*2.38±0.04 β-catenin 2.94±0.03*4.62±0.06 Cyclin D1 2.47±0.04*3.08±0.03

3 討論

分泌型卷曲相關蛋白（sFRP）家族包含5 個成員，在胚胎發生和腫瘤發生過程中具有重要作用［7］。sFRP2 是間充質干細胞產生的分泌蛋白，在增強間充質干細胞抗凋亡能力和缺氧條件下的自我更新方面具有重要作用［8］。sFRP2 通常被認為能夠將Wnt配體與卷曲受體隔離開來，而事實上sFRP2 是賴氨酸去甲基化酶2A（KDM2A）的靶基因。在許多癌癥細胞中，sFRP2 啟動子高甲基化伴隨著Wnt 信號通路激活［9］。改善血管內皮功能是治療動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等心血管疾病的關鍵。在體內炎癥損傷狀態下，內皮細胞半滲透性屏障破壞，導致血管內液體溢出、組織水腫和血栓形成，在這種狀態下也會發生細胞骨架損傷。LPS 是革蘭陰性菌細胞壁的主要促炎分子之一，可激活血管內皮細胞，使白細胞滲透血管壁，增加血管通透性［10］。內皮細胞對LPS的反應是呈Toll樣受體4（TLR4）依賴性的，可導致促炎細胞因子的后續釋放及黏附分子表達增加，進一步刺激炎癥級聯，嚴重時會引發系統炎癥反應綜合征［11-12］。本研究結果顯示，≥10 μg/mL的LPS可引起HUVECs 細胞存活指數明顯降低，因此選擇10 μg/mL LPS 作為后續實驗的作用濃度。本研究中過表達組sFRP2 mRNA和蛋白表達明顯高于陰性對照組，提示成功在HUVECs中過表達sFRP2基因；過表達組細胞凋亡率及促進細胞凋亡的相關蛋白Bax 和Cleaved Caspase-3表達明顯低于陰性對照組，抑制細胞凋亡的相關蛋白Bcl-2 表達明顯高于陰性對照組，提示過表達sFRP2 可減少LPS 誘導的HUVECs細胞凋亡。

Wnt/β-catenin 通路在多細胞真核生物中高度保守，在細胞增殖、黏附等生理過程中具有至關重要的作用，并參與炎癥性疾病、纖維化疾病和多種癌癥的發生過程。Wnt通路組件的不恰當激活發生于多種疾病的發病過程中，如Wnt1、Cyclin D1、β-catenin等。研究發現，LPS 刺激可使人支氣管上皮細胞中Wnt5a 和 β-catenin 表達升高，且 Wnt 抑制劑能抑制LPS 引起的人支氣管上皮細胞炎癥反應［6］。本研究結果顯示，過表達組Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 表達均低于陰性對照組，提示sFRP2 抑制細胞凋亡的作用可能與其抑制Wnt/β-catenin通路有關。

綜上所述，過表達sFRP2 可減少LPS 誘導的HUVECs 細胞凋亡，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號通路有關，為改善血管內皮損傷提供了新的治療靶點。