基于網絡藥理學方法對芪歸八味湯治療病毒性心肌炎作用機制的分析

高敏，職利琴 ，吳倩，郭洪兆

1 陜西中醫藥大學，陜西咸陽712046；2 西安市第五醫院

病毒性心肌炎（VMC）是指感染病毒之后引起的，以心肌非特異性炎癥為主要病變的心血管系統疾病，好發于年輕人群，被認為是青少年群體發生心力衰竭、心律失常和猝死的一個重要原因［1］。目前，臨床上針對VMC 的治療以抗病毒治療和營養心肌為主，但療效并不樂觀。單純的西醫治療容易使病毒產生耐藥性，有研究在西醫基礎上聯合使用中藥治療VMC，結果顯示可有效改善患者癥狀，提高其免疫力、降低復發風險［2-3］。芪歸八味湯以當歸補血湯和生脈散為基礎方，主要由黃芪、當歸、太子參、麥冬、五味子、柏子仁、天冬、紅花八味藥組成，主治氣陰兩虛型VMC。網絡藥理學是由英國藥理學家HOPKINS［4］首次提出的，主要是以系統生物學和生物信息學為基礎，全面分析藥物與疾病和靶點之間的“多成分、多靶點、多途徑”協同作用關系。2019年10 月—2020 年9 月，本研究采用網絡藥理學方法分析芪歸八味湯治療VMC的作用機制。現報告如下。

1 方法

1.1 藥物活性成分篩選與靶點預測 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp. php）數據庫中，根據ADME 參數設置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，收集芪歸八味湯中各中藥的化學成分及其作用靶點。因TCMSP 數據庫中未收錄麥冬，在中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM）數據庫中獲得麥冬的化學成分，設置“藥物—靶點”模型的相似性閾值≥20、P≤0.05，選取符合條件的活性成分。選擇UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）的UniProtKB 搜索功能，將靶蛋白轉換為對應的靶基因，得到所有靶基因的官方名稱。將得到的靶點信息進行統計整理，利用Cytoscape3.7.2 軟件以8 味中藥篩選后的化學成分與標準化的基因名稱為基礎，根據Degree 值大小依次排列，繪制藥物—成分—靶點關系網絡圖。

1.2 藥物—疾病共同靶點獲取 在OMIM 數據庫（http：//omim. org/）和 Genecards 數據庫，以“Viral myocarditis”為檢索詞，收集VMC 的疾病相關靶點。將去重后的疾病靶點與藥物靶點通過R軟件繪制韋恩圖，獲得藥物—疾病共同靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網絡構建及核心靶點篩選 將關鍵靶點輸入String 數據庫（https：//stringdb. org/），研究物種設置為Homo sapiens，置信度設置為0.9，隱藏游離的節點，獲得可視化關于藥物—疾病共同靶點的PPI 網絡圖，并導出TSV 文件。將PPI 網絡圖導入 Cytoscape3.7.2，通過 Network Ana?lyzer 進行分析，將平均 Degree 值為 8.870 4、平均緊密度為0.427 0、平均介度為0.014 9作為標準，三項均高于上述標準的靶點即為芪歸八味湯治療VMC的核心靶點。

1.4 核心靶點的基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將芪歸八味湯治療VMC 的核心靶點進行GO 功能和KEGG通路分析，設置P＜0.01。按照每個條目涉及的靶點數目進行排序，根據P值大小列出前20 條路徑，篩選排名靠前的生物過程和通路。

2 結果

2.1 活性成分篩選結果 TCMSP 數據庫對芪歸八味湯中7 味中藥的活性成分進行檢索，結果顯示共收集 616 種成分（黃芪 87 種、當歸125 種、太子參 25種、五味子130種、天冬32種、柏子仁28種、紅花189種），篩選并刪除無靶點的成分后得到42 種有效成分（黃芪16種、當歸2種、太子參5種、五味子7種、天冬 7 種、柏子仁 5 種、紅花 16 種）；BATMAN-TCM 數據庫檢索結果顯示麥冬的有效成分共18種。其中，太子參、紅花、天冬和當歸的重復成分為β-谷甾醇，太子參和紅花的重復成分為木犀草素，紅花和黃芪的重復成分為山柰酚，紅花、黃芪和天冬的重復成分為槲皮素，紅花、當歸、天冬和麥冬的重復成分為豆甾醇。8 味中藥共對應有效基因靶點1 252 個，剔除重復靶點后最終獲得479個藥物靶點。

2.2 藥物—成分—靶點關系網絡圖繪制結果 藥物—成分—靶點關系網絡圖包括552個節點（藥物8個、成分 66 個、靶點479 個）和1 706 條邊。成分按Degree 值大小排名前10 位分別為槲皮素（448）、豆甾醇（210）、β-谷甾醇（140）、山柰酚（115）、木犀草素（112）、尿苷（44）、花生四烯酸（38）、7-O-methyliso?mucronulatol（38）、pseudoprotodioscin_qt（38）、鳥 嘌呤核苷（38），靶點按Degree 值大小排名前10 位分別為 PTGS2（41）、NCOA2（37）、PTGS1（31）、PRSS1（22）、PGR（20）、AR（20）、GABRA1（20）、DPP4（18）、SCN5A（17）、ADRB2（17）。

2.3 藥物—疾病共同靶點獲取 將OMIM 和Gene?cards 數據庫的VMC 相關靶點匯總，刪除重復靶點后得到1 058個疾病靶點，與479個藥物靶點取交集，得到124個藥物—疾病共同靶點。

2.4 PPI 網絡圖構建及核心靶點篩選結果 PPI 網絡圖包括124 個節點、479 條邊，篩選出的核心靶點有19 個，分別為腫瘤壞死因子（TNF）、JUN、RELA、AKT1、MAPK1/8/14、白細胞介素（IL）-4/6、TP53、CXCL8、EGFR、FOS、VEGFA、CASP8、EGF、CTNNB1和EDN1。見表1。

表1 芪歸八味湯治療VMC的核心靶點信息

2.5 核心靶點的GO 功能富集分析結果 GO 功能富集分析得到2 739 個條目，在生物學過程（BP）中富集2 502 條路徑，主要參與對細菌來源分子的反應、對脂多糖的反應、對氧化應激的反應、外源性凋亡信號通路等過程；在細胞成分（CC）中富集92條路徑，主要涉及薄膜筏、膜微域、膜區域等部位；在分子功能（MF）中富集145 條路徑，主要涉及受體配體活動、細胞因子受體結合等方面。

2.6 核心靶點的KEGG通路富集分析結果 KEGG通路富集分析得到164 條通路途經，富集排名靠前的通路主要有糖尿病并發癥中的AGE/RAGE 信號通路（靶點數目32）、TNF 信號通路（靶點數目29）、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路（靶點數目30）、乙型肝炎（靶點數目31）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路（靶點數目32）、南美錐蟲病（靶點數目26）、IL-17 信號通路（靶點數目27）、人巨細胞病毒感染（靶點數目30）、MAPK信號通路（靶點數目30）、丙型肝炎（靶點數目26）、甲型流感（靶點數目26）、人類免疫缺陷病毒1 感染（靶點數目25）、細胞凋亡（靶點數目24）等。

3 討論

VMC 根據臨床癥狀劃屬于“溫病”“心悸”“胸痹”“怔忡”等范疇。因患者體質虛弱，又復感溫熱病邪，溫毒之邪犯及心脈發為本病。該病病位在心，涉及脾、肺、腎等臟器，屬本虛標實之證［5］。目前臨床藥物治療策略大多是抗氧化、營養心肌、抗病毒等，但效果并不理想。芪歸八味湯是筆者導師多年的臨床經驗總結，由當歸補血湯和生脈散為基礎方加減，主治氣陰兩虛型VMC，共八味藥。黃芪、當歸補氣養血，太子參、麥冬和五味子滋陰止汗、益氣復脈，柏子仁和天冬滋心陰、安心神，紅花調和諸藥、通暢血運。研究表明，黃芪皂苷可以顯著抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α 等表達，太子參多糖可抑制心肌細胞凋亡，麥冬改善心肌缺血，五味子能減少炎癥反應對心肌的損害，紅花強心，天冬降壓、減慢心率，柏子仁營養心肌［6］。因此，芪歸八味湯全方八味中藥對心血管系統有不同的保護作用。

本研究通過對藥物—成分—靶點網絡圖分析可知，芪歸八味湯主要的化學成分是槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等。研究表明，槲皮素具有抗病毒、抗炎、清除活性氧自由基等作用，可通過降低 VMC 小鼠 TGF-β1和 TNF-α 表達抑制 NF-κB通路的激活［7-9］。豆甾醇可顯著抑制 TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達，并通過下調NF-κB p65 和p38 MAPK，增加 IL-10 釋放［10］。JINA 等［11］研究發現，β-谷甾醇具有抗炎作用，可減少IL-1、TNF-α 等炎癥因子釋放。木犀草素可以減輕炎癥反應，并通過調節NF-κB 和MAPK 信號通路來緩解氧化應激［12］。由此可見，芪歸八味湯的化學成分主要通過抗炎以及降低氧化應激來治療VMC。

本研究PPI 結果顯示，芪歸八味湯作用于VMC的 核 心 靶 點 主 要 是 TNF、JUN、RELA、AKT1、MAPK1/8/14、IL-4/6、TP53、CXCL8、EGFR、FOS、VEGFA、CASP8、EGF、CTNNB1 和 EDN1。TNF 是一類促炎因子，而VMC 的心肌病變可能與TNF-α 有關，高水平的TNF-α 會對心肌造成損傷；此外，TNF-α 還可以激活NF-κB 信號通路，進而促進炎癥因子分泌［13］。JUN 主要參與細胞增殖、免疫相關以及凋亡抑制等信號通路［14］。AKT 是 PI3K/AKT 信號通路中的核心橋梁點，參與炎癥過程、心血管疾病等的發生發展［15-16］；此外，AKT 可以促進 CASP 磷酸化，進而抑制細胞凋亡［17］。鞏子漢等［18］發現，MAPK1 不僅可以正向調控TNF-α 表達，還可以和MAPK14 共同參與炎癥反應過程。由此可見，芪歸八味湯可通過多個靶點治療VMC。

本研究KEGG 富集分析結果顯示，排名靠前的通路有糖尿病并發癥中的AGE/RAGE 信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、乙型肝炎、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、人巨細胞病毒感染、MAPK 信號通路、TNF 通路、細胞凋亡、IL-17 信號通路等。TNF通路主要促進TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子釋放，加重機體的炎癥反應［19］。IL-17信號通路是一條經典的促炎通路，參與機體炎癥反應過程［20］。MAPK 信號通路涉及細胞生長、增殖和凋亡等功能［21］。楊超茅等［22］發現，AGE/RAGE 信號通路可以激活NADPH 氧化酶，繼而活化NF-κB，從而釋放大量 TNF-α、IL-1 等炎癥因子。TNF 通路和IL-17信號通路與炎癥反應密切相關，提示芪歸八味湯可能主要作用于炎癥因子來抑制炎癥反應，從而發揮治療VMC的作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學的方法系統研究了芪歸八味湯治療VMC 的作用機制，表明芪歸八味湯中的活性成分可通過調節AGE/RAGE、MAPK、TNF、IL-17信號通路等，減輕炎癥反應、抑制細胞凋亡，發揮治療VMC 的作用，證實了中藥復方多靶點、多途徑、協調治療疾病的過程。