滇白珠乙酸乙酯提取物對腹瀉小鼠的止瀉作用及其胃腸功能調節機制觀察

農志歡，何飛 ，蘇華，董曉倩

1 廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021；2 廣西中醫藥研究院；3 廣西中藥質量標準研究重點實驗室

腹瀉對兒童健康危害極大，是造成小兒營養不良、生長發育障礙及死亡的重要原因之一，也是引起兒童患病和死亡的第二大病因，在許多發展中國家甚至是造成兒童死亡的第一原因［1-3］。滇白珠是杜鵑花科白珠樹屬植物全株［4］，是一種經典的瑤藥。現代藥理學研究表明，滇白珠具有抗炎鎮痛、抑菌、抗氧化等藥理作用［5-6］。前期研究發現，滇白珠提取物能顯著減少蓖麻油所致腹瀉小鼠的腹瀉次數，減輕新斯的明導致的胃排空和小腸推進功能亢進，抑制大鼠離體回腸痙攣性收縮［7］。本課題組前期進一步分離滇白珠提取物，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等有機溶劑進行萃取，并對各個部位進行了藥效初步篩選，發現滇白珠的乙酸乙酯部位活性最強。2018 年 12 月—2019 年 4 月，本研究制備了滇白珠的乙酸乙酯提取物，并觀察其對腹瀉小鼠的止瀉作用及胃腸功能調節機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF 級SD 大鼠8 只，體質量200～220 g；昆明小鼠200 只，體質量18～22 g；雌雄參半，均購自廣西醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK桂2014-0002；動物觀察室設置溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%，雌雄分飼，適應性喂養1 周。藥物與試劑：滇白珠購自廣西金秀瑤族自治縣，由廣西中醫藥研究院何開家主任（中藥師）鑒定為杜鵑花科植物滇白珠的全株。易蒙停（生產批號：180511650）購自西安楊森制藥有限公司，甲硫酸新斯的明（生產批號：1208171）購自河南潤弘制藥股份有限公司，硫酸阿托品（生產批號：93120220）購自成都制藥一廠，氯化乙酰膽堿（生產批號：112120103）購自上海源葉生物科技有限公司，蓖麻油（生產批號：20120813）購自廣東省化學試劑工程技術研究開發中心，番瀉葉（生產批號：18101702）購自國藥仁樂堂河北藥業有限公司。

1.2 藥物制備

1.2.1 滇白珠乙酸乙酯提取物（簡稱滇白珠提取物）制備 取滇白珠藥材1 kg，水煮3 次，每次加10倍量水。第 1 次煮 2 h，第 2、3 次各煮1 h，濃縮水液至密度約為1.10。加95%乙醇至溶液的乙醇含量達70%，靜置沉淀，收集上清液。沉淀物用70%乙醇洗滌3次，合并乙醇液，回收溶劑，得到乙醇浸膏。加水溶解，用乙酸乙酯進行萃取，回收溶劑，得到滇白珠提取物，得率約為0.8%。

1.2.2 番瀉葉提取物制備 稱取300 g 番瀉葉藥材，加入100 ℃純凈水1.5 L，水浴保溫且不斷攪拌30 min，雙層濾布壓榨過濾，獲得濃度為20%的番瀉葉藥汁900 mL，4 ℃冰箱保存。

1.3 滇白珠提取物對腹瀉小鼠止瀉作用的觀察

1.3.1 滇白珠提取物對小腸性腹瀉小鼠止瀉作用的觀察 取昆明小鼠50只，隨機分成5部分，每部分10只，分別按照體質量灌胃給予20、10、5 g/kg（按生藥計算）的滇白珠提取物及6 mg/kg 易蒙停、等體積溶媒（3.2%吐溫-80溶液），1次/d，持續7 d。末次給藥1 h 后，所有小鼠灌胃給予蓖麻油10 mL/kg，立即將小鼠單只置于鼠籠中，觀察并記錄5 h內每間隔1 h小鼠的正常便數、稀便數、稀便級，根據稀便率、稀便級計算腹瀉指數（腹瀉指數=稀便率×稀便級）。

1.3.2 滇白珠提取物對大腸性腹瀉小鼠止瀉作用的觀察 取昆明小鼠50只，隨機分成5部分，每部分10 只。參照 1.3.1 的方法進行分組處理，1 次/d，持續7 d。末次給藥1 h 后，所有小鼠灌胃給予番瀉葉提取物2.5 g/kg，后續操作及觀察指標同1.3.1。

1.4 滇白珠提取物對小鼠胃腸推進運動影響的觀察

1.4.1 滇白珠提取物對正常小鼠胃腸推進運動影響的觀察 采用炭末推進試驗。取昆明小鼠50只，隨機分成5 部分，每部分10 只。參照1.3.1 的方法進行分組處理，1 次/d，持續5 d。第4 天給藥后小鼠禁食（不禁水）24 h，第5 天末次給藥1 h 后，每間隔2 min 對不同組號順序的小鼠灌胃給予黑色炭末糊0.8 g。20 min 后脫頸處死小鼠，快速剖腹，結扎小鼠胃賁門和幽門，取出胃組織。先稱量胃全重，將胃內殘留物清理干凈，再稱量胃凈重。計算小鼠胃內殘留物的重量（胃內殘留物重量=胃全重-胃凈重）及胃內殘留率［胃內殘留率（%）=胃內殘留物重量/炭末糊重量×100%］。同時取出小腸，自然平鋪在尺子上，測量小腸總長度（胃幽門至回盲部的長度）及炭末糊推進長度（胃幽門至炭末糊推進前沿的長度），計算小腸推進率［小腸推進率（%）=炭末糊推進前沿的長度/小腸總長×100%］。

1.4.2 滇白珠提取物對胃腸功能亢進小鼠胃腸推進運動影響的觀察 采用炭末推進試驗。取昆明小鼠50只，隨機分成5部分，每部分10只。參照1.3.1的方法進行分組處理，1 次/d，持續5 d。第4 天給藥后小鼠禁食（不禁水）24 h，第5天末次給藥1 h后，每間隔2 min 對不同組號順序的小鼠皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg，20 min后每間隔2 min對不同組號順序的小鼠灌胃給予黑色炭末糊0.8 g，后續操作及觀察指標同1.4.1。

1.5 滇白珠提取物對大鼠離體小腸張力影響的觀察

1.5.1 離體腸段制備 取SPF 級SD 大鼠8 只，禁食不禁水24 h。脫頸處死，快速剖腹，取一段小腸，置于4 ℃臺氏液中，剪成若干約1 cm的腸段備用。

1.5.2 滇白珠提取物對大鼠離體正常小腸張力影響的觀察 預先開啟ZH-Z離體器官檢測系統，使水浴溫度保持在37 ℃左右，通入空氣，調節好空氣流量。取1.5.1制備的1條小腸段，兩端對角穿線將其放在盛有20 mL 臺氏液的恒溫浴管中。連接生物機能實驗系統，調節離體小腸段基礎張力為0.5 g 左右。待其運動穩定后，往浴槽中分別加入9、4.5、2.25 g/mL 的滇白珠提取物100 μL（終濃度分別為44.78、22.39、11.19 μg/mL）及0.02 mg/mL 硫酸阿托品（終濃度為0.1μg/mL）、溶媒各100μL，分別記錄小腸藥物作用前的基礎張力以及作用2.5、5.0 min的張力。計算作用2.5、5.0 min 的張力抑制率。張力抑制率（%）=（基礎張力-作用后張力）/基礎張力×100%。實驗重復8次，取平均值。

1.5.3 滇白珠提取物對大鼠離體張力亢進小腸張力影響的觀察 取1.5.1 制備的1 條小腸段置于浴槽中，待腸段收縮穩定后，加入氯化乙酰膽堿（終濃度15 mg/L），使小腸張力亢進。待小腸運動3.0 min后，往浴槽中分別加入9、4.5、2.25 g/mL 的滇白珠提取 物 200 μL（終 濃 度分 別為 89.11、44.56、22.28 μg/mL）及0.02 mg/mL 硫酸阿托品（終濃度為0.2 μg/mL）、溶媒各200 μL，分別記錄小腸藥物作用前的基礎張力及加入乙酰膽堿平臺期、藥物作用2.5 min、藥物作用5.0 min 的張力。計算給藥后2.5、5.0 min 的張力抑制率。張力抑制率（%）=（加入乙酰膽堿平臺期張力-作用后張力）/（加入乙酰膽堿平臺期張力-基礎張力）×100%。實驗重復8次，取平均值。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0 統計軟件。計量資料以-x±s 表示，方差齊時多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊時采用Dunnett′sT3檢驗，兩組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同藥物作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級及腹瀉指數比較 與溶媒作用后比較，20、10 g/kg滇白珠提取物及易蒙停作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級及腹瀉指數均降低，5 g/kg滇白珠提取物作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、腹瀉指數均降低（P均＜0.01）。見表1。

表1 不同藥物作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級及腹瀉指數比較（±s）

表1 不同藥物作用后小腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級及腹瀉指數比較（±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.01；與易蒙停作用后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

藥物20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒n 10 10 10 10 10稀便率（%）0.53±0.13*0.62±0.11*0.64±0.07*#0.54±0.13*0.80±0.08稀便級1.00±0.00*1.03±0.11*1.09±0.20 1.04±0.09*1.21±0.10腹瀉指數0.53±0.13*0.63±0.09*0.69±0.09*##0.55±0.12*0.96±0.13

2.2 不同藥物作用后大腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級及腹瀉指數比較 與溶媒作用后比較，20、10 g/kg滇白珠提取物及易蒙停作用后大腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級及腹瀉指數均降低，5 g/kg滇白珠提取物作用后大腸性腹瀉小鼠稀便級、腹瀉指數均降低 （P均＜0.01）。見表2。

表2 不同藥物作用后大腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級及腹瀉指數比較（±s）

表2 不同藥物作用后大腸性腹瀉小鼠稀便率、稀便級及腹瀉指數比較（±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.01；與易蒙停作用后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

藥物n 稀便率（%） 稀便級 腹瀉指數20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒10 10 10 10 10 0.34±0.06*0.44±0.07*#0.53±0.06##0.33±0.13*0.58±0.08 1.03±0.06*1.08±0.08*1.06±0.07*1.06±0.16*1.30±0.12 0.35±0.06*0.48±0.08*#0.57±0.06*##0.34±0.12*0.76±0.11

2.3 不同藥物作用后正常小鼠胃內殘留率、小腸推進率比較 見表3。

表3 不同藥物作用后正常小鼠胃內殘留率、小腸推進率比較（%，±s）

表3 不同藥物作用后正常小鼠胃內殘留率、小腸推進率比較（%，±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與易蒙停作用后比較，#P＜0.05。

藥物20 g/kg滇白珠提取物10 g/kg滇白珠提取物5 g/kg滇白珠提取物易蒙停溶媒n 10 10 10 10 10胃內殘留率53.33±12.71 52.27±15.43 51.16±18.03 54.72±14.36 44.61±15.76小腸推進率49.31± 5.94**53.14± 5.69*58.18± 9.54#47.74±11.71*58.68± 5.49

2.4 不同藥物作用后胃腸功能亢進小鼠胃內殘留率、小腸推進率比較 見表4。

表4 不同藥物作用后胃腸功能亢進小鼠胃內殘留率、小腸推進率比較（%，-x±s）

2.5 不同藥物作用前后大鼠離體正常小腸張力及 張力抑制率比較 見表5。

表5 不同藥物作用前后大鼠離體正常小腸張力及張力抑制率比較（±s）

表5 不同藥物作用前后大鼠離體正常小腸張力及張力抑制率比較（±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與硫酸阿托品作用后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

藥物44.78μg/mL滇白珠提取物22.39μg/mL滇白珠提取物11.19μg/mL滇白珠提取物硫酸阿托品溶媒基礎張力（g）0.60±0.07 0.60±0.04 0.59±0.07 0.62±0.08 0.61±0.09作用2.5 min張力（g）0.31±0.06**##0.33±0.06**##0.39±0.12*0.43±0.06*0.55±0.12作用2.5 min張力抑制率（%）49.01± 9.29**##44.51±11.57**#34.55±11.11**30.06±11.18**9.83± 9.69作用5.0 min張力（g）0.25±0.06**##0.27±0.05**##0.37±0.14*0.39±0.07*0.52±0.14作用5.0 min張力抑制率（%）58.52± 8.70**##54.86± 8.63**##38.15±13.54**36.36±14.27**15.33±13.11

2.6 不同藥物作用前后大鼠離體張力亢進小腸 張力及張力抑制率比較 見表6。

表6 不同藥物作用前后大鼠離體張力亢進小腸張力及張力抑制率比較（±s）

表6 不同藥物作用前后大鼠離體張力亢進小腸張力及張力抑制率比較（±s）

注：與溶媒作用后比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與硫酸阿托品作用后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

藥物89.11μg/mL滇白珠提取物44.56μg/mL滇白珠提取物22.28μg/mL滇白珠提取物硫酸阿托品溶媒基礎張力（g）0.49±0.05 0.48±0.05 0.46±0.04 0.48±0.04 0.49±0.07加入乙酰膽堿平臺期張力（g）3.27±0.31 3.34±0.91 3.62±1.04 3.23±0.54 3.16±0.27作用2.5 min張力（g）1.41±0.20**##2.12±0.58*##2.84±0.72*##0.97±0.20**2.90±0.36作用2.5 min張力抑制率（%）67.25±4.49**##43.09±4.15**##24.07±6.74**##82.28±5.84**10.02±7.23作用5.0 min張力（g）1.13±0.21**#1.80±0.50*##2.41±0.61##0.87±0.20**2.52±0.47作用5.0 min張力抑制率（%）77.32± 6.83**#54.00± 5.26**##37.78± 8.31*##86.05± 6.45**24.51±11.76

3 討論

滇白珠具有抗炎鎮痛、抑菌、抗氧化等藥理作用［5-6］。前期研究采用不同極性的有機溶劑對滇白珠水提取物進行萃取及活性驗證，發現乙酸乙酯萃取物在抗腹瀉和胃腸功能調節方面均有較好的活性，可能是滇白珠抗腹瀉和胃腸功能調節的活性部位［7］。易蒙停通用名為鹽酸洛哌丁胺膠囊，用于各種原因引起的非感染性急、慢性腹瀉的對癥治療。此外，易蒙停可抑制腸道平滑肌的收縮，減少腸蠕動；還可減少腸壁神經末梢釋放乙酰膽堿，通過膽堿能和非膽堿能神經元局部的相互作用，直接抑制蠕動反射［8-9］。因此，本研究將易蒙停作為腹瀉和胃腸功能試驗的陽性對照藥。

番瀉葉作用于大腸，可促進結腸的水和電解質凈分泌，加速大腸內容物輸送而致瀉。蓖麻油刺激小腸，能損害腸黏膜細胞，引起炎癥而致瀉［10-11］。本研究結果顯示，不同濃度滇白珠提取物對小腸性和大腸性腹瀉小鼠均具有顯著的止瀉作用，其中20 g/kg滇白珠提取物的作用效果與易蒙停相當；這提示滇白珠提取物可應用于各種原因引起的腹瀉治療，具有多靶點、多機制作用的特點。

腹瀉的發生與胃腸道功能息息相關。胃具有收納食物，對食物進行酸化、研磨形成食糜，并節奏性地排送入腸的功能［12］。胃腸運動的調節涉及交感神經系統、副交感神經系統、腸神經系統等多種神經系統，其中胃腸道平滑肌細胞膜上M 膽堿能受體發揮著非常重要的作用。副交感神經末梢釋放的乙酰膽堿可激活M 膽堿能受體，而膽堿酯酶抑制劑新斯的明能保護乙酰膽堿免于破壞，使胃腸道平滑肌的M膽堿能受體持續激活，造成胃腸運動機能亢進。研究顯示，胃腸內容物推進速度減慢，可能由胃排空速度減慢或小腸推進速度減慢兩方面因素促成的［13-14］。本研究采用新斯的明建立胃腸功能亢進小鼠模型，以炭末推進情況反映小鼠的胃腸推進功能，結果顯示不同濃度的滇白珠提取物對正常小鼠和胃腸功能亢進小鼠的小腸推進率均有明顯的抑制作用，并可明顯增加胃腸功能亢進小鼠的胃內殘留率，但是對正常小鼠的胃內殘留率影響不大，這提示滇白珠提取物可能通過對胃腸道M 膽堿能受體的抑制作用發揮胃腸功能調節作用。而滇白珠提取物對正常小鼠的胃內殘留率影響不明顯，分析原因可能是其對胃腸亢進狀態小鼠推進功能的抑制作用大于正常小鼠，也可能與其對小腸運動的抑制作用大于對胃排空的抑制作用有關。為明確滇白珠提取物對M 膽堿能受體的作用特點，本研究采用離體小腸張力實驗進行驗證。乙酰膽堿可興奮小腸平滑肌運動，而阿托品為M 膽堿能受體拮抗劑，對胃腸痙攣有抑制作用［15］。本研究結果顯示，不同濃度滇白珠提取物與阿托品對大鼠離體小腸平滑肌的自發張力均有顯著抑制作用，同時對乙酰膽堿所造成的小腸平滑肌收縮也有明顯的抑制作用。因此，滇白珠提取物與阿托品一樣能競爭性拮抗乙酰膽堿所造成的M膽堿能受體作用。

綜上所述，滇白珠提取物對大腸及小腸性腹瀉小鼠均具有明顯的止瀉作用，其機制可能與通過拮抗M 膽堿能受體而增加胃內殘留率、降低小腸推進速度、解除胃腸道平滑肌痙攣有關。