兩種檢測技術在血液篩查中對乙肝病毒篩查的應用

德央 曲吉

西藏自治區血液中心 西藏拉薩 850000

血液安全是目前全世界廣泛關注的焦點，為了保證輸血的安全可靠，世界衛生組織（WHO）建議對每一位獻血者進行健康征詢及血源性傳染病的篩查[1]。隨著科學的進步發展，Busch 等科研人員通過研究證實核酸檢測能將HBV、HCV 和HIV 血清學檢測的窗口期縮短[2]。本中心也于2019 年開展核酸檢測工作，本文以初步了解拉薩地區無償獻血者的乙肝病毒感染情況，對比了NAT 與ELISA 檢測技術在乙肝病毒篩查中的臨床意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

本中心于2019年1月～2020年9月采集的5999 例無償獻血者標本，初篩合格，且符合《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2011）。每位無償獻血者共收集3 管標本，第1 管為分離膠促凝真空采血管用于EIA 檢測及谷丙轉氨酶檢測；第2 管為EDTA-K2 抗凝真空采血管用于核酸檢測；第3 管同為EDTA-K2 抗凝真空采血管，是核酸檢測備用管（需要復檢時使用）。核酸管采集后保證4h 內離心（3500rpm/min），三管均保存于2～8℃，24h 內檢測（備用管于-20℃凍存，只可復溶一次）。

1.2 方法

1.2.1 ELISA 篩查試劑與儀器

每個檢測項目均采用兩種不同的試劑盒來進行檢測。HbsAg 由上海科華及廈門英科新創，實驗操作過程均嚴格按照實際說明書進行。儀器:E-STARLET 全自動加樣儀和酶免分析儀。

1.2.2 NAT 檢測試劑與儀器

篩選出ELISA 檢測合格的標本進行核酸試驗單檢流程，嚴格按照達安基因核酸試劑說明書做好試劑準備、加樣及PCR 擴增準備工作。儀器為DA3500 全自動核酸提取儀和安譽AFD9600 擴增儀。

1.2.3 復檢及確認

對鑒定檢測均為反應性的獻血者需定期采取血樣進行ELISA、核酸檢測，觀察該獻血者ELISA 檢測是否轉陽，以給獻血者作出最終解釋。

1.3 檢測結果判定

1.3.1 ELISA 結果判定

＜Cutoff 值判為陰性，≥Cutoff 值判為陽性。兩種試劑均反應性則為陽性不合格，否則為陰性；若只有其中一種試劑為陽性則該樣本兩種試劑皆復檢兩孔，均為陰性則合格，均為陽性或其一為陽性則判不合格。

1.3.2 NAT 結果判定

1.3.2.1 質控品結果判定（暨批實驗有效性）

陰性質控品除內標Ct ≤40 外，其他均無值，否則重測；陽性質控品檢測項均為Ct ≤40，否則重測；室內質控品檢測項均為Ct ≤45，否則重測。

1.3.2.2 待測標本結果判定（暨單測試有效性）

在本批次試驗質控有效，并且內標（IC）有效的條件下，本批次試驗結果有效且可參考。陽性判斷標準為有明顯S 型擴增曲線且標本檢測結果Ct 值≤45，則結果判為有反應性。陰性判斷標準為無明顯S 型擴增曲線，標本檢測結果的Ct 值為“無值”，且相應的內對照結果Ct 值≤40。若本次結果出現反應性，則取該樣本的備用管雙孔復檢，若再次呈反應性，則判定該項目為陽性，若無反應性則判為陰性。

1.3.2.3 內標檢測的有效性判定

標本測定結果如果為核酸陰性，則內標結果必須為陽性，否則標本的測定結果無效重新測定。標本測定結果如果為核酸陽性，內標結果可以不做考慮。

2 結果

2.1 HBV 檢出率

在5999 份血液標本中，采用ELISA 和NAT 兩種方法檢測后，共檢出HBV 陽性標本65 份，HBV檢出率為1.08%（65/5999）。

2.2 兩種檢查的特異性、靈敏度

2.2.1 ELISA 的特異性、靈敏度結果

5999 份 血 液 標 本 中，ELISA 檢 出33 份 標 本HBV 陽性，檢出率0.55%。追蹤1 月后，再次檢測出30 份陽性。因此，ELISA 在BHV 病毒檢測中的靈敏度為52.38%、特異性為50.77%。

2.2.2 NAT 的特異性、靈敏度結果

NAT 檢測方法，對5999 份血液標本中檢出65份BHV 陽性，檢出率1.08%。追蹤1 月后，再次檢測出63 份陽性。對于NAT 在檢測BHV 中的靈敏度100%、特異性為96.92%。

2.3 兩種檢測特異性、靈敏度的對比 見表

3 討論

本中心地處西藏自治區首府拉薩，拉薩地區流動人口數量龐大，居民的乙肝疫苗接種意識不強，而且針對傳染病的防范意識薄弱。2011～2015 年的調查數據顯示，拉薩地區獻血人群HBsAg 檢出率是1.06%，高于當時的銀川、南京等地區[3,4]。本次檢測結果顯示，2019～2020 年拉薩地區獻血人群HBsAg 檢出率為1.08%，和往年水平相當。提示西藏自治區血液安全問題依然存在，不容忽視，采血人員需要重點關注；此外需繼續加強對乙肝等傳染病的健康教育，提高乙肝疫苗的接種率。

本組結果顯示，ELISA 檢測方法的靈敏度為52.38%，特異性50.77%，均處于較低水平。文獻研究顯示，以抗原抗體為檢測對象的酶聯免疫檢測方法，“窗口期”較長，尤其是抗體，由于抗體的產生需要從病毒進入體內刺激機體發生免疫反應，再到抗體足以被檢出，這個過程需要更長的時間，因此導致酶聯免疫檢測最重要的漏檢因素為“窗口期”漏檢[5,6]，此外，也可能會存在隱匿性的HBV 感染（OBI），此感染者由于自身免疫或病毒的變異等因素導致抗原結構改變，導致血清學檢測呈陰性，本組就有30 人份血樣就是“窗口期”，漏檢率較高，因此在臨床工作中對于一次檢測HBV 陰性者，一定要有半個月以上的追蹤、復查。不可掉以輕心，這關系到受血者的健康問題。但因為ELISA 檢測在檢驗室中應用交廣，且時間長。基層實驗室均配有，操作簡單，費用不高，社會效益高。NAT 檢測可檢出存在于血清中HBV-DNA[7]，能在早期檢測出HBV感染，可以忽略“窗口期”直接發現病毒。本組中NAT 的靈敏度為100%，特異性為96.92%，處于較高水平，故，作者建議有條件的醫療機構在血液篩查中盡可能的采用NAT 檢測，當然在安全血液的篩選試驗中，NAT 也能夠很好的與ELISA 檢測起到互補作用。通過兩種檢測方法比較，結果顯示核酸檢測能更進一步的保證臨床供血的安全可靠性，在發現“窗口期”及隱匿性病毒感染的檢測中，發揮著重大的作用。