特發性膜性腎病患者血清抗PLA2R抗體和抗THSD7A抗體的表達及診斷價值

姜傳學，李龍海，王 建，宋東旭，董 葆

膜性腎病即膜性腎小球腎炎，是指免疫復合物在腎小球毛細血管中過度沉積導致的腎病綜合征，臨床表現為高脂血癥、水腫、低蛋白血癥、蛋白尿等[1]。膜性腎病可分為特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)與繼發性膜性腎病(secondary membranous nephropathy, SMN)，其中IMN是自身抗體介導，補體、腎小球足細胞膜成分等參與的自身免疫性疾病，具有器官特異性[2]。自從Heyman腎炎模型確認以來，膜性腎病的重要靶抗原逐漸受到臨床的廣泛關注，目前認為M型磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor, PLA2R)及1型血小板反應蛋白7A域(thrombospondin type-1 domain-containing 7A, THSD7A)是導致膜性腎病發生的兩大致病靶抗原[3]。本研究分析IMN患者血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達水平，旨在評價兩種抗體的表達在IMN診斷及病情評估中的臨床價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2017年7月—2019年12月阜陽市第二人民醫院腎內科住院行腎穿刺活檢的初次治療腎病患者217例，其中IMN 97例，非膜性腎病120例。IMN組男54例，女43例；年齡36～79(51.73±12.46)歲；病程8～58(32.10±0.25)個月。非膜性腎病組男69例，女51例；年齡35～79(51.99±12.35)歲；病程9～60(32.22±0.31)個月；包括IgA腎病45例，局灶節段性腎小球硬化癥18例，微小病變腎病17例，系膜增生性腎小球腎炎18例，足細胞病12例，過敏性紫癜性腎炎4例，糖尿病腎病6例。兩組的性別、年齡、病程比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入與排除標準 ①納入標準：均為行腎穿刺活檢初次治療患者；活檢前未使用過糖皮質激素或免疫抑制劑；臨床資料完整。②排除標準：經臨床癥狀、體征、實驗室檢查、腎活檢病理診斷為SMN患者，如繼發于自身免疫性疾病或慢性感染的腎病；合并惡性腫瘤；具有明確的毒性物質與藥物接觸史，包括硫普羅寧、鉛中毒、汞中毒、鎘中毒等。

1.3方法

1.3.1標本收集：所有患者檢測當日取空腹靜脈血4 ml，置于無菌抗凝試管中，3500 r/min轉速條件下離心15 min，取上清液，置于冰箱中貯存待測；同時開始留取24 h尿行尿蛋白定量檢測。血清白蛋白水平測定采用溴甲酚綠比色法，尿蛋白定量檢測采用比濁法，尿β2-微球蛋白、尿免疫球蛋白G、尿α1-微球蛋白檢測采用酶聯免疫吸附法。

1.3.2血清抗PLA2R抗體測定：采用酶聯免疫吸附法檢測，試劑盒購自德國歐蒙，試劑盒抗PLA2R抗體檢測范圍：2～1500 RU/ml，≤20 RU/ml代表陰性表達。具體步驟：樣本緩沖液按照1∶100的比例稀釋，向反應微孔分別加入標準品、陰性對照、陽性對照、稀釋后的樣本各100 μl，18～25℃條件下溫育30 min，用稀釋后的清洗液清洗反應微孔3次，注意清洗時微孔中緩沖液保留時間至少為60 s，倒置微孔板，吸水紙上拍打去除殘存的清洗液。微孔中加入100 μl酶結合物，18～25℃條件下溫育30 min，再次清洗。微孔中加入100 μl色原/底物液、18～25℃溫度條件下避光溫育15 min。依照上述步驟中相同的順序和速度滴加100 μl終止液至微孔中。設定好酶標儀參數，450 nm/630 nm比色。

1.3.3血清抗THSD7A抗體測定：采用酶聯免疫吸附試驗檢測，試劑盒來自美國BioLegend，試劑盒抗THSD7A抗體濃度范圍3～200 pg/ml，<3 pg/ml代表陰性表達。具體步驟：將稀釋的50 μl標準品、陰性對照、陽性對照、血清樣本分別加入反應微孔；以覆膜覆蓋，在37℃溫度條件下溫育30 min。以稀釋后清洗緩沖液清洗反應微孔5次，注意清洗時微孔中緩沖液保留時間至少為60 s，倒置微孔板，吸水紙上拍打去除殘存的清洗液。除對照孔外，向每個反應微孔中加入50 μl酶結合物，以覆膜覆蓋，在37℃溫度條件下溫育30 min，再次清洗。向每個反應微孔加入50 μl酶結合物A和酶結合物B，震動30 s，37℃條件下溫育30 min。向每個反應微孔中加入50 μl終止液。在37℃溫度條件下溫育30 min，設定好酶標儀參數，450 nm/630 nm比色。

1.4IMN診斷標準[4]光鏡下顯示腎小球基底膜出現帶狀空泡變性，馬松三色法染色可見上皮下出現嗜復紅蛋白的沉積，且隨著患者疾病的進展，腎小球基底膜彌漫呈現進一步增厚，并伴有系膜細胞以及基質中度彌漫增生，毛細血管腔狹窄。最后腎小球基底膜鏈環狀，系膜基質增加，被擠壓的毛細血管袢閉塞，腎小球結節硬化，呈現球性或節段性硬化。

1.5臨床分期 依照Ehrenreieh和Churg標準[5]：①Ⅰ期：腎小球足突融合，腎小球基底膜呈現輕度增厚，上皮細胞下出現沉積的小塊電子致密物。②Ⅱ期：基底膜明顯彌漫增厚，上皮細胞下出現沉積的大塊電子致密物，且有反應性增生形成的釘突相連。③Ⅲ期：增生的腎小球基底膜環繞包裹電子致密物，且其中一部分被吸收，表現為大小、形狀、密度不同的致密物和電鏡透亮區。④Ⅳ期：腎小球基底膜明顯增厚，由于電子致密物被吸收，變得與腎小球基底膜的密度接近，而觀察不到。

1.6統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以率(%)表示，比較行χ2檢驗；通過受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達對IMN的診斷效能；采用多因素Logistic回歸分析血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體陽性表達的影響因素。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達比較 IMN組抗PLA2R抗體陽性表達59例(60.82%)，非膜性腎病組10例(8.33%)；IMN組陽性表達率高于非膜性腎病組(P<0.01)。IMN組抗THSD7A抗體陽性表達11例(11.34%)，非膜性腎病組無陽性表達；IMN組陽性表達率高于非膜性腎病組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組腎病患者血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達比較[例(%)]

2.2血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達對IMN診斷效能分析 血清抗PLA2R抗體診斷IMN的準確度、靈敏度、特異度分別為77.88%、60.82%、91.67%；血清抗THSD7A抗體診斷IMN的準確度、靈敏度、特異度分別為60.37%、11.34%、100.00%。血清抗THSD7A抗體診斷特異度高于抗PLA2R抗體(χ2=10.435，P=0.001)，準確度、靈敏度低于抗PLA2R抗體(χ2=15.589、51.495，P均<0.001)。見圖1。

圖1 血清抗PLA2R抗體及抗THSD7A抗體表達對IMN診斷效能分析

2.3不同抗體表達IMN患者相關病理和生化指標比較 不同腎小管間質損傷、血清白蛋白、尿免疫球蛋白G、尿β2-微球蛋白、尿α1-微球蛋白水平患者抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體陽性表達結果與陰性表達比較差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.4影響IMN患者血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達的多因素分析 將上述單因素分析中差異有統計學意義的指標納入多因素Logistic回歸模型，分別以抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達結果作為因變量，以上述差異有統計學意義的指標作為自變量，并賦值：腎小管間質損傷(<25%=0，≥25%=1)、血清白蛋白(<25 g/L=0，≥25 g/L=1)、尿免疫球蛋白G(<24.98 mg/L=0，≥24.98 mg/L=1)、尿β2-微球蛋白(<1.17 mg/L=0，≥1.17 mg/L=1)、尿α1-微球蛋白(<40.35 mg/L=0，≥40.35 mg/L=1)。結果顯示，腎小管間質損傷≥25%、血清白蛋白<25 g/L、尿免疫球蛋白G≥24.98 mg/L、尿β2-微球蛋白≥1.17 mg/L、尿α1-微球蛋白≥40.35 mg/L是IMN患者血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達的影響因素(P<0.05，P<0.01)。見表3和表4。

3 討論

IMN是一種原因不明的自身免疫性疾病，既往研究認為，腎小球足細胞出現致病性抗原，原位免疫復合物的形成，進一步激活補體系統，使得基底膜結構發生改變，濾過屏障受損[6-7]。

表2 不同抗體表達IMN患者相關病理和生化指標比較(例)

表3 影響IMN患者血清抗PLA2R抗體表達的多因素Logistic回歸分析

表4 影響IMN患者血清抗THSD7A抗體表達的多因素Logistic回歸分析

隨著對IMN靶抗原研究的進展，PLA2R、THSD7A等靶抗原逐漸被人們認識。PLA2R可分為N型和M型，人體M型PLA2R主要在腎組織中表達，屬于C型外源性凝集素家族，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，病理狀態下參與炎癥與急性腎損傷過程[8]。Li等[9]研究100例IMN患者抗PLA2R抗體陽性表達情況，結果顯示有52例檢測出抗PLA2R抗體，陽性表達率為52%，而在SMN、腫瘤相關性腎病等其他類型中未檢出。THSD7A為IMN免疫復合物沉積導致的分子損傷病理機制提供了新的分子生物學基礎[10]。THSD7A在嚙齒類動物足細胞中呈現高表達，特異性定位于足細胞胞體、足突、隔膜裂孔等，集中表達于人腎足細胞膜表面的跨膜蛋白，由胞外部分、跨膜域、胞內尾部組成[11]。IMN是與足細胞相關的自身免疫性疾病，在一定條件下其結構發生變化，從而暴露抗原表位，誘導自身抗體形成，補體系統的激活誘導足細胞損傷和凋亡，形成蛋白尿，抗THSD7A抗體水平與IMN疾病活動存在關系[12]。

本研究中IMN患者抗PLA2R抗體陽性率60.82%，低于Tian等[13]研究結果，這可能是由于本研究抗體測定采用酶聯免疫吸附法，而上述報道采用免疫熒光檢測，檢測結果存在一定的差異。本研究中IMN患者血清抗THSD7A抗體陽性率為11.34%，非膜性腎病患者該抗體無陽性表達，表明抗THSD7A抗體診斷IMN特異性為100%，高于抗PLA2R抗體，但是抗THSD7A抗體陽性不能排除繼發性因素，其檢測準確度與敏感度均低于抗PLA2R抗體。本研究中IMN患者血清抗THSD7A抗體檢出率并不高，與李正東和張任[14]研究結果一致。分析可能原因為：①存在其他靶抗原；②病情平穩或處于緩解期，免疫反應不活動；③實驗人數或技術限制；④存在潛在繼發性因素等。

本研究中腎小管間質損傷≥25%是影響抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達的獨立危險因素，抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體從炎癥介導與免疫調節兩方面參與了腎間質纖維化的形成。IMN患者由于促紅細胞生成素生成障礙，血紅蛋白降低，損傷腎小球濾過屏障，造成大量蛋白尿、低白蛋白血癥，血清白蛋白含量降低，這些生理病理改變也通過氧化應激、炎癥反應、血流動力學改變、細胞外基質沉積等，進一步加重腎病病理損傷，血清蛋白和尿蛋白反映膜性腎病患者病情。Zhang等[15]研究發現，當蛋白尿水平高時，抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體滴度較高，治療后，隨著尿蛋白含量降低和血清白蛋白濃度的恢復，抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體滴度下降甚至消失，Pearson相關性分析結果顯示抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體滴度與血清白蛋白呈現負相關，與尿蛋白水平呈現正相關。本研究分析影響IMN患者血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達的因素，結果顯示血清白蛋白、尿免疫球蛋白G、尿β2-微球蛋白、尿α1-微球蛋白均是抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體陽性表達的影響因素，IMN患者蛋白尿的產生主要與腎小球足細胞和基底膜結構及功能完整性遭到破壞有關。對于血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體陽性表達的IMN患者來說，二者的合成分泌，引起機體免疫學異常反應，導致腎臟病理損傷，引起蛋白尿的形成。根據電鏡中上皮下免疫復合物沉積，將膜性腎病病理分為4個階段，在本研究中，不同病理階段IMN患者的抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達無明顯差異，故抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達與上皮下免疫沉積物的出現之間可能沒有關聯。此研究結果與既往Pozdzik等[16]的研究報道一致。

綜上所述，血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體對于IMN的診斷具有一定的臨床價值，血清白蛋白含量較低，尿蛋白含量較高的患者血清上述抗體陽性表達水平越高。血清抗PLA2R抗體、抗THSD7A抗體表達在反映患者病情方面具有一定的臨床意義，可作為IMN患者檢測的重要血清學指標。