結核性胸膜炎臨床診斷的研究進展

李瑞雪，羅 浩，張育泉，盧 琴，杜 娟，程義局

結核性胸膜炎(tuberculous pleurity, TBP)為臨床常見的胸膜疾病，指體液于胸膜腔異常聚集，可因胸膜自身疾病或其他肺部病變所致，也可由全身性疾病所致，在我國TBP為引起滲出性胸腔積液的常見類型，占54.8%[1]。結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)是引起TBP主要病原體，TBP發病機制主要為MTB直接侵入到胸膜或經淋巴管血行播散到胸膜，呼吸道是其主要傳播通道，而排菌肺結核是主要傳染源，但MTB不僅可產生內外毒素，也能在組織細胞內大量繁殖菌體成分，加上代謝物質毒性、機體對菌體成分產生免疫損傷均是引起炎癥反應的重要因素，在人體出現MTB感染后，全身除頭發及牙齒外各器官均可致病，但多發于肺臟[2]。TBP發病早期癥狀常不典型，影像學檢查特異性低，因而其主要依賴于實驗室檢查，而進入胸腔的MTB數量較少，在胸腔積液中較難發現細菌學的直接證據，故TBP的診斷仍有較多亟待解決的問題[3]。本文主要對TBP的實驗室診斷技術現狀及其進展作一綜述，以期為TBP的研究提供借鑒。

1 細菌學診斷技術

因MTB為導致TBP的原因，故獲得直接的細菌學證據為診斷TBP的金標準。而目前TBP的細菌學診斷主要通過涂片法或培養法從胸腔積液中找到MTB，另外是通過核酸擴增技術獲取MBT的基因片段。

1.1涂片法 涂片法是待檢標本涂抹于載玻片上，并經自然烘干后對其予以抗酸染色，然后在顯微鏡下進行觀察，該法中抗酸染色時簡便、快捷且成本低，存在較高的特異性，但有敏感性低的不足，且無法區分是死菌或活菌，也無法區分MTB與非MTB[4]，此外胸膜病理檢查有創傷性，費用高，部分患者依從性差，實施起來有一定難度[5]。

1.2培養法 培養法是將標本接種于培養基，在37℃的孵育箱中進行孵育，定期觀察，同時對有菌落生長者記為陽性，無菌落生長者則記陰性。培養法一般分為固體培養法與液體培養法，前者主要為羅氏培養法，是MTB檢測的金標準，操作簡便、經濟成本少，但檢測周期耗時較長，大約需要4周才能得出結果，且檢測靈敏度不高，容易延誤病情。液體培養法則可直接通過涂片進行抗酸染色確定是否存在MTB，并可立即進行分枝桿菌鑒定與藥敏試驗，該法檢出時間短，且需人為操作較少，人為因素誤差少，有一定優勢[6]。

1.3快速現場評價技術(rapid on site evaluation, ROSE) ROSE是隨介入診斷技術發展起來的病理學診斷技術，類似于外科手術的術中冰凍病理技術，其主要目的在于快速評價介入標本取材是否合格，指導介入醫師是否可終止活檢，該技術最早由美國密西根大學病理科教授提出，在氣管鏡活檢過程中應用該技術可提高肺惡性腫瘤活檢組織合格率，從而提高疾病診斷率[7]。ROSE技術主要是由有豐富經驗的細胞病理學專家現場對活檢標本進行Diff-Quick染色觀察，并向操作者反饋標本采集是否合格的一種方法，有經驗的病理學專家還可根據該技術現場提供初步診斷[8]。ROSE診斷中，合格組織的顯微鏡下可觀察到淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，類上皮細胞或多核巨細胞。如鏡下觀察到有紅細胞、纖維素滲出與壞死樣病變，不應判斷為組織合格。但ROSE也有一定局限性，如操作需專業的病理學醫師進行現場染色、讀片，不合格的ROSE診斷可能使穿刺提前終止，而導致活檢失敗，甚至有研究指出，ROSE技術并不能提高標本合格率及疾病診斷率，僅減少活檢過程中的穿刺次數[9]。

2 病理學診斷

病理學診斷在較多疾病診斷中被視為金標準，在TBP診斷中也被視為除傳統細菌學外的最重要診斷依據，主要有穿刺針盲穿活檢和胸腔鏡直視下活檢2種途徑，胸膜活檢可在B超引導下進行操作，穿刺針盲穿活檢有操作簡便、相對安全、經濟、有效、痛苦少等優點，尤其對TBP有較高診斷率，但對結核病總診斷率有待提高。

2.1超聲引導下穿刺 超聲引導下胸膜穿刺具有微創、安全、費用少等優勢，能實時觀察目標胸膜，避開肋間血管和隨呼吸運動的肺組織，并按照穿刺需要將穿刺方向及角度進行變換以完成穿刺，尤其針對初治早期局限性胸膜增厚或伴胸壁結核結節患者有重要意義，此外超聲能實時引導活檢針穿刺局限增厚性病變胸膜，避免損傷正常胸膜組織，較以往盲穿技術可明顯提高活檢取材的病理學診斷率，減少相關并發癥[10]。早期曹兵生等[11]發現，超聲引導下切割式胸膜活檢有安全、方便、經濟、準確率高等特點，但胸膜厚度、患者病程、年齡等仍是影響穿刺確診率的重要因素。

2.2胸腔鏡直視下活檢 內科胸腔鏡用于診療胸膜疾病最早起源于瑞典，20世紀90年代出現了外科胸腔鏡，即電視輔助胸腔鏡(video-assisted thoracoscopic surgery, VATS)，其出現極大促進了內科胸腔鏡發展，內科胸腔鏡相比于外科胸腔鏡的優勢在于內科醫師在支氣管鏡室局部麻醉下即可操作完成，此外一次性用品使用少，治療費用低，且切口單一，此外也能用于粘連剝脫、診斷活檢[12]。目前，在臨床上內科胸腔鏡有普通硬質胸腔鏡、支氣管鏡代胸腔鏡、可彎曲電子胸腔鏡，其中可彎曲電子胸腔鏡在普通硬質胸腔鏡基礎上，前端增加了可彎曲功能，使術中視野與操作范圍擴大，為目前應用較廣泛、發展前景較好的內科胸腔鏡[13]。莊亞琴等[14]發現，在TBP的診治中，內科胸腔鏡結合ROSE技術可明顯縮短胸腔鏡下胸膜活檢次數(平均6次)，減少操作時間(平均36 min)，有較高臨床應用價值。此外,內科胸腔鏡技術兼具吸引胸腔積液、松解胸腔內粘連的治療意義，已成為TBP的常規診療手段。楊雯等[15]采用內科胸腔鏡對TBP進行診斷，結果發現其靈敏度、特異度分別為70.0%、100.0%。王君等[16]觀察到，內科胸腔鏡下，TBP有急性滲出性改變、增生性改變、胸膜肥厚粘連并纖維素沉積樣改變、胸膜粘連肥厚伴結節樣改變4種，內科胸腔鏡檢查安全有效，有重要診斷價值。但胸腔鏡有費用高、技術要求高等特點，不宜在基層醫院開展。

3 分子生物學診斷技術

3.1GeneXpert MTB/RIF GeneXpert MTB/RIF檢測技術是WHO推薦的以新型半巢式實時熒光定量法對MTB進行檢測的體外分子診斷技術，其檢測方便、快捷，對檢測人員的要求較低，整個過程僅需2 h，檢測系統包含利福平耐藥相關基因rpoB基因的引物，在檢出MTB含量的同時也可檢出陽性樣本是否存在利福平耐藥[17]。余婷婷等[18]發現，GeneXpert MTB/RIF診斷TBP的靈敏度、特異度分別為70.0%、88.0%，對快速診斷TBP及利福平耐藥情況有較高判斷價值。孟素華[19]發現，GeneXpert MTB/RIF檢測技術診斷TBP的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率分別為54.94%、100.00%、100.00%、19.78%、59.44%。李文博等[20]的研究顯示，GeneXpert MTB/RIF系統檢測TBP陽性率為71%，高于涂片染色法的39%，且GeneXpert MTB/RIF檢測對利福平耐藥性敏感度為83.30%，特異度為95.74%，對TBP的早期診斷與治療均有較大價值。整個胸腔積液GeneXpert MTB/RIF檢測過程在封閉環境中開展，手動時間短，一般不超過5 min，不易對操作者與周圍環境造成危害，且能在2 h內明確患者是否患有結核病及是否對利福平耐藥，為臨床上早期、快速診斷結核病提供了實驗室依據，但因其檢測價格昂貴，在我國并未大量開展。

3.2聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR) 近年來分子診斷技術發展迅速，利用實時熒光定量PCR診斷TBP具有取材方便、靈敏度好、準確性高等特點，其主要以核酸擴增為基礎，對于生長緩慢細菌，PCR診斷有不可比擬的優勢，且痰液、胸腔積液、腦脊液、尿液等各種體液均可作為標本，能為患者早期診斷、治療過程中的動態監控及療效評估提供一定依據。胸腔積液中有較豐富蛋白質、非編碼RNA及代謝產物，可反映宿主疾病病理進程與免疫狀態，在胸腔積液中尋找可指示TBP疾病進程與免疫狀態的分子標志物已成為研究熱點。其中微小RNA(miRNA)有較高的穩定性，且能快速準確地定量，有望成為非侵襲性生物標志物以追蹤疾病的發生、發展及預后[21]。有研究以胸腔積液外泌體為研究對象，應用二代測序，在肺腺癌、TBP及其他良性胸腔積液中發現171個差異miRNA，而TBP、惡性胸腔積液中共發現22個miRNA表達量相對較高[22]。Liu等[23]研究發現，miR-21、miR-24對TBP惡性胸腔積液有鑒別診斷價值，因此檢測miRNA可能對TBP的鑒別診斷具有重要意義。

3.3高分辨率溶解曲線技術 有學者經建立Taq Man探針陣列卡-高分辨率溶解分析法對MTB進行檢測，發現該法作為一種分子藥敏檢測方法，能高效檢出inhA、katG、rpoB、embB、rpsL、rrs、eis、gyrB、pncA genes等耐藥基因[24]。與基因測序法相比，Taq Man探針陣列卡-高分辨率溶解分析的準確率為96.1%，高于固體藥敏法的87.0%，因此是一種快速而全面的分子藥物敏感檢測方法。

3.4環介導等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification, LAMP) LAMP為核酸擴增技術，只需于恒定溫度下核酸即能發生擴增反應，因該技術操作方法簡單，無須昂貴的儀器設備，查看擴增結果僅需肉眼觀察即可，能保持核酸擴增速度、敏感度高等優點，整個技術僅需1 h，對于MTB的檢出也有一定臨床意義[25]。

4 細胞免疫學診斷技術

4.1結核菌素皮內試驗(purified protein derivative, PPD) PPD為采用結核菌純蛋白衍生物對人體進行檢測，觀察其能否引發遲發型皮膚超敏反應，判定人體對MTB是否有免疫力，繼而判定是否曾被MTB感染，但該法易受卡介苗(bacillus calmette-guérin, BCG)影響而出現假陽性。張亞武和吳青[26]的研究顯示，PPD檢測TBP的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為48.4%、76.1%、57.7%、68.6%，均低于結核感染T淋巴細胞酶聯免疫斑點試驗(T-SPOT.TB)的96.8%、91.3%、88.2%、97.7%。部分首次予以PPD陰性患者也會出現“暴發效應”，在1周后再次進行PPD試驗可出現陽性結果，該法主要用于判定人體對MTB有無免疫力，因而PPD診斷結核病的特異度低，可能與接種BCG、非MTB接觸后致敏或真正結核致病菌有關。

4.2γ干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay, IGRA) IGRA為一種以細胞反應為基礎的免疫學診斷方法，若過往感染過MTB，則體內T淋巴細胞再次遇到MTB所特有的抗原時，會釋放干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)。IGRA在臨床中有較多優勢[27]，①所用刺激MTB特有抗原在BCG中缺失，即便受試者在前期接種過BCG也不會引起交叉反應，且較少與其他多數環境中分枝桿菌起交叉反應；②IGRA試劑盒設有陽性對照與空白對照，結果判斷主觀因素少，不易受人為影響。當然其也對血液標本有較高要求，即需要采集新鮮血液，且實驗室設備要求也較高，檢測費用昂貴。同時和PPD一樣，IGRA難以判斷受試者為潛伏感染或是活動性肺結核，也較難判斷目前潛伏感染后期是否有發展為活動性結核病的風險，對免疫功能不全者也可能出現不確定性結果[28]，因此有一定局限性。

4.3T-SPOT.TB T-SPOT.TB通過對外周血單個核細胞(PBMCs)受結核抗原刺激后釋放的IFN-γ進行檢測而評估抗原特異性T淋巴細胞應答反應，并通過對斑點數量進行準確計算而推測體內是否存在MTB產生的效應T淋巴細胞[29-30]。MTB感染機體后被巨噬細胞吞噬，但無法完全清除，巨噬細胞凋亡后釋放出大量特異性抗原：早期分泌靶向抗原、培養濾液蛋白10，并遞呈給CD4、CD8等T淋巴細胞，使其激活并釋放大量IFN-γ，因早期分泌靶向抗原與培養濾液蛋白10為MTB基因組RD1區相同操縱子編碼的蛋白，因而T-SPOT.TB與BCG及絕大多數非MTB均無交叉反應，假陽性率較低[31]。此外T-SPOT.TB在肺結核中有較高檢出率，隨結核菌數量不斷增多，被加工呈遞的抗原隨之增加，促使抗原特異性效應T淋巴細胞數量呈增多趨勢，從而在外周血T-SPOT.TB檢測中顯示為斑點數量增多[32]。楊瑩瑩和侯曉東[33]的研究顯示，TBP患者應用超聲引導下胸膜活檢+外周血T-SPOT.TB檢測可顯著提高診斷敏感度、準確度，不僅利于疾病早期診斷，防止進展至纖維化包裹，也可為臨床判斷病情、制定治療方案提供有效信息，利于強化療效、改善預后。早期蓋林林等[34]的研究顯示，胸腔積液單個核細胞(PEMCs)T-SPOT.TB檢測對診斷TBP的靈敏度、陰性預測值分別為97.9%、97.6%，高于PBMCs的81.3%、78.1%，而PEMCs特異度80.6%低于PBMCs的88.9%，PEMCs陽性預測值87.0%與PBMCs的90.7%比較差異無顯著性。郭曉桐等[35]發現外周血T-SPOT.TB檢測對TBP診斷靈敏度88.9%高于腺苷脫氨酸(adenosine deaminase, ADA)活性檢測的46.00%，而特異度86.1%低于ADA活性檢測的94.4%，將二者聯合后靈敏度提高至92.10%。莊妍和賴雁平[36]發現，在結核病流行地區，外周血T-SPOT.TB較低，為67.0%～90.5%，主要由結核疫區存在較多潛伏感染患者所致，理論上活動性結核感染的T-SPOT.TB斑點數應較潛伏性感染多，但事實上當潛伏性結核感染者免疫功能良好時，少量抗原刺激即可激發出活躍的免疫反應，或當活動性結核患者免疫功能低下時，大量抗原刺激也不足以激起有效的免疫反應，在此種背景下選擇特異性較高的臨界值，如依據受試者工作特征曲線確定最佳界值更有意義。賈文青[37]的研究表明，T-SPOT.TB對TBP診斷的靈敏度、特異度較高，且不受免疫因素影響對免疫抑制合并TBP患者有較高價值，但老年、體質量指數≥25 kg/m2為T-SPOT.TB假陰性的危險因素，而既往有結核病史可能是T-SPOT.TB假陽性的危險因素，不能盲目診斷。因此在應用T-SPOT.TB前應對患者進行高危因素排查。

5 生化指標及細胞因子等檢查

TBP患者于感染MTB后產生具有結核特異性記憶T淋巴細胞，這種細胞長期存在于機體免疫系統，MTB再次入侵時受結核特異性抗原刺激，可轉化為效應T淋巴細胞，這些效應T淋巴細胞在MTB特異性抗原刺激下能分泌IFN-γ、白細胞介素-2(interleukin-2, IL-2)、腫瘤壞死因子等多種細胞因子，因而檢測這些因子對TBP有一定診斷價值[38]。

5.1ADA ADA是一種和機體細胞免疫水平有關的重要核酸代謝酶，存在于人體脾臟、胸腺、其他淋巴組織中，尤以淋巴細胞中含量最高。ADA由T淋巴細胞產生，活性與淋巴細胞激活及活化有關，在發生TBP后，受結核抗原刺激人體中淋巴細胞明顯增多，因此ADA在胸腔積液中含量明顯增多，可作為早期結核性與非結核性胸腔積液鑒別診斷、病情觀察及療效評估的常規檢測項目[39]。但ADA可受年齡、淋巴細胞數量、MTB的細菌負荷等多因素影響而易被漏診，對于缺乏惡性證據的胸腔積液，ADA升高證據仍可作為抗結核治療的指征[40]。Kim等[41]也發現，ADA檢測時存在檢查結果部分重疊現象，造成診斷困擾，且ADA在胸腔積液中升高較難與感染性、腫瘤性或其他所致的胸腔積液相鑒別，易導致誤診。

5.2乳酸脫氫酶(LDH) LDH為一種氫化還原酶，是糖代謝中的主要酶類，其廣泛分布在各組織器官的體細胞中，無組織特異性，胸腔積液中LDH常用以鑒別漏出液及滲出液，當LDH>200 U/L或胸腔積液與血清中LDH水平比值>0.6則為滲出液，LDH于化膿性感染積液中含量最高，為正常血清30倍，其次為惡性積液，結核性積液略高于血清[42-43]。王愛民等[44]發現，血清及胸腔積液中LDH及ADA聯合檢測可提高TBP診斷準確度，達96.0%，高于單一指標檢測結果81.3%、88.7%。

5.3IFN-γ TBP患者胸腔積液中淋巴細胞受MTB細胞壁蛋白刺激產生IFN-γ，后者可激活巨噬細胞并增強對細菌的殺傷力，在局部抗MTB感染中有防御作用，因而TBP患者的外周血IFN-γ水平一般較低，胸腔積液中水平較高[45]。Xu等[46]的研究顯示，ADA聯合IFN-γ對TBP有較高診斷價值。

5.4細胞因子與其他生化檢查 特異性細胞因子與TBP的發生發展有密切聯系，其中IL-10為Th2型細胞因子，多由淋巴細胞分泌，可抑制Th1細胞增殖,以及抑制腫瘤壞死因子、IL-2、IL-4等促炎細胞因子分泌，而發揮抗炎、免疫耐受及清道夫功效。IL-27為一種二聚體細胞因子，有促進炎癥及抑制炎癥的雙重作用，在TBP免疫抑制中，IL-27可促進初始CD4+T淋巴細胞增殖并向Th1細胞分化，且增強結核性保護性免疫反應，因而IL-27可能參與TBP發病[47]。Wang等[48]的meta分析結果也表明，IL-27可用于診斷高患病率的TBP，陰性結果也可用于排除所有流行環境中的TBP。李芳等[49]的研究顯示，IL-27在TBP診斷時的曲線下面積、靈敏度、特異度分別為0.96、100.0%、94.4%，而IFN-γ診斷TBP的曲線下面積、靈敏度、特異度分別為0.79、61.4%、89.5%，ADA診斷TBP的曲線下面積、靈敏度、特異度分別為0.92、78.6%、92.1%，將三者聯合檢測時特異度高達97.4%，聯合檢測時有較高價值。此外一些白細胞介素家族成員如IL-22[50]、IL-35、IL-37[51]等與IL-27一樣，均有較強的抗炎作用，可經下調腫瘤壞死因子-α、IL-6、IFN-γ等因子表達而發揮抗炎作用，其中IL-35為新發現的抗炎及免疫耐受細胞因子，可經調控調節性T與B淋巴細胞而發揮免疫性或炎癥性免疫抑制作用，IL-35能刺激Foxp3+Treg細胞分泌而抑制CD4+細胞活化發揮抗宿主病效應，此外IL-35也參與多種自身免疫疾病、惡性腫瘤的發生、發展，參與TBP發病，可對其進行診斷。

6 綜合性診斷

目前為提高TBP診斷效能，常采用兩項及以上實驗室指標進行診斷。如吳景秋等[52]將胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯合檢測診斷TBP，發現其診斷靈敏度86.21%低于T-SPOT.TB單獨檢測的98.62%，而特異度100.00%高于T-SPOT.TB單獨檢測64.41%。王震等[53]發現,TBP患者外周血T-SPOT.TB與胸腔積液ADA檢測陽性率高，采用二者聯合檢測的方式可提高診斷靈敏度、特異度，可明顯降低誤診率與漏診率，對疑似TBP有快速、準確的診斷價值。王曉娟等[54]發現，外周血T-SPOT.TB聯合胸腔積液ADA可作為較好的診斷TBP標準，聯合檢測診斷效能顯著提高,靈敏度、特異度分別為98.63%、98.69%。周鵬飛等[55]采用IGRA聯合抑制性細胞因子(IL-10、IL-35、IL-37)診斷TBP的靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值分別為94.00%、96.77%、95.06%、97.92%、90.91%高于各指標單獨診斷，因此聯合檢測時診斷價值更高。也有采用三項及以上項目的報道，如金芬華等[56]發現，IL-33、ADA與外周血T-SPOT.TB聯合檢測診斷結核性胸腔積液的靈敏度、特異度、曲線下面積分別為88.5%、100.0%、0.962，可作為診斷TBP的有效指標。李虹澤等[57]利用Xpert MTB/RIF、胸腔積液ADA或血清ADA、T-SPOT.TB診斷TBP時，發現其可明顯提高靈敏度，且有較高陽性預測值和診斷準確率，能避免漏診現象，對TBP有重要輔助診斷價值。章靜等[58]的研究顯示，外周血T-SPOT.TB和胸腔積液中ADA、LDH對TBP有重要臨床價值，以外周血T-SPOT.TB診斷效能最優。程麗平和肖和平[59]發現，胸腔積液ADA、TB-DNA-PCR與外周血T-SPOT.TB串聯檢測診斷TBP特異度好，能明顯降低誤診率，而并聯檢測敏感度高，能減少漏診。陳敏等[60]發現，細胞圖文報告、IGRA與ADA平行聯合檢測診斷TBP的敏感度、特異度分別為100.0%、72.1%，系列聯合檢測敏感度、特異度分別為70.7%、100.0%。易斌等[61]發現，胸腔積液ADA、IFN-γ及TB-DNA聯合檢測診斷TBP有較高特異度，達98.9%。Zhang等[62]發現，采用T-SPOT.TB聯合INF-γ、IL-27對TBP有較好診斷價值。

綜上所述，目前對于TBP的診斷策略以細菌學、病理學、分子生物學、細胞免疫與綜合性診斷為主。隨社會進步、科技迅速發展，以及實驗室檢測技術、方法不斷更新，將來會有更靈敏、更特異的實驗室檢查方法問世，這些將為臨床對TBP開展早期診療提供重要依據，使TBP的診斷與治療更準確而及時，為患者帶來便利。