孕早期血清miR-125b、miR-124檢測在唐氏綜合征產前篩查中的價值分析

曾芳，何鳳萍，楊祥康

(1.惠州市第六人民醫院檢驗科，廣東 惠州 516211；2.舟山市婦女兒童醫院產前診斷實驗室，浙江 舟山 316000)

唐氏綜合征(down syndrome，DS)又稱為21三體綜合征，主要表現為智力低下、特殊面容、生長發育障礙，可伴發多系統疾病。據調查，新生兒DS發病率為1/600～1/800[1]。我國每年約有3萬例DS患兒出生，其發病率位列各種出生缺陷的第三位[2]。孕期針對胎兒DS進行篩查和診斷是降低DS患兒出生率，提高優生優育水平的關鍵手段，目前學術界公認的DS篩查方法為傳統的血清學DS篩查及無創產前基因檢測[3]，其中血清學產前篩查由于具有安全、簡便、高效的優勢而被作為臨床常規篩查手段。但在產前篩查中，血清學DS篩查存在的孕早期檢出率低等問題越來越受到關注，據統計，傳統血清學DS篩查的檢出率仍只能達到約60%[4]。因此，近年來，超聲檢測胎兒頸項透明層(nuchal translucency，NT)厚度、高通量測序技術檢測母體外周血胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，cff DNA)等輔助手段被用于提高DS篩查的檢出率，但這些檢測方法仍然無法代替傳統的羊水細胞染色體核型分析[5]。微小RNA(microRNAs，miRNAs/miR)是近年來學術界廣泛關注的表觀遺傳學血清標志物。有研究[6]結果顯示DS的發生和發展與多種miRNAs的異常表達有關，但miRNAs能否作為孕早期血清標志物用于輔助篩查診斷DS仍存在爭議。基于此，本研究選取了70例經傳統血清學篩查或胎兒NT檢測提示DS高風險的孕婦作為研究對象，分析孕早期血清miR-125b、miR-124水平在DS產前篩查中的價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2019年1月在舟山市婦女兒童醫院接受孕早期(10～14周)二聯血清學唐篩檢查及胎兒頸項透明層(NT)檢查，至少一項結果提示DS胎兒高風險的70例孕婦，經羊水穿刺取羊水細胞培養和染色體核型分析，35例確診為DS胎兒孕婦作為病例組，35名為正常妊娠孕婦作為對照組。兩組孕婦均簽署知情同意書自愿參與本研究，研究方案經醫院醫學倫理委員會審核通過。病例組孕婦經本人和家屬同意后終止妊娠。排除標準：雙胎或多胎妊娠孕婦；通過輔助生殖手段受孕者；具有DS家族遺傳史或既往DS患兒分娩史的孕婦；合并惡性腫瘤、重度高血壓、糖尿病及慢性心腦血管病的孕婦。

1.2 觀察指標和檢測方法

1.2.1 基線資料 通過查閱病歷及生育手冊收集兩組孕婦的年齡、孕周、孕次、產次、體質指數(body mass index，BMI)、有害物質接受史、吸煙史、服用葉酸時間短于3個月比例等基線資料。

1.2.2 血清學篩查 孕早期留取受檢孕婦空腹外周血3 mL，離心后取血清置于-20 ℃保存，72 h內送實驗室檢測。采用ACCESS2 型化學發光免疫分析儀(美國Beckman Coulter公司)對血清妊娠相關血漿蛋白A、人絨毛膜促性腺激素水平進行檢測。采用Muldeale軟件根據血清學指標檢測結果及孕婦的年齡、體重、孕周、孕產史等變量計算DS風險值，當風險值≥1∶270時判定為高風險，記為血清學篩查陽性。

1.2.3 胎兒NT篩查 采用iU22B多普勒超聲儀(美國Philips公司)對胎兒NT厚度進行檢測，超聲探頭頻率設定為2.0～5.0 MHz，檢查時將胎兒的頭部和上胸部的超聲圖像放大，于胎兒頸部皮膚高回聲帶深部尋找NT，其在超聲圖像顯示為低回聲和無回聲，于NT最寬處對其與皮膚的垂直光帶距離進行測量。每例胎兒均重復檢測3次，取其中最大值作為測量值，當NT>2.5 mm時判定為DS高風險，記為NT篩查陽性。

1.2.4 血清miR-125b、miR-124相對表達量 孕早期留取受檢孕婦空腹外周血2 mL，離心后取血清置于-18 ℃待測。采用Trizol reagent RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)對血清樣本總RNA進行提取，采用7 500型熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀(美國ABI公司)應用實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法對血清miR-125b、miR-124相對表達量進行檢測，以U6為內參，RNA催化合成采用cDNA：PrimerScriptTMRT試劑盒，RNA擴增采用SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒，待測RNA和內參的PCR擴增引物序列見表1，反應體系為SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)5 μL、PCR Forward Primer 0.4 μL、Uni-miR qPCR Primer 0.4 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、cDNA模板 1μL、dH2O 3 μL，共10 μL。反應條件為：50 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共反應40個循環。采用熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行分析，采用Opticon Monitor軟件計算循環閾值(Ct)，采用2-△△Ct法計算待測RNA的相對表達量，計算公式為：△Ct=Ct目標基因-Ct內參基因，△△Ct=△Ct檢測樣品-△Ct基準樣品。

表1 miR-125b、miR-124及內參的PCR擴增引物

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組孕婦基線資料的比較

兩組孕婦年齡、孕周、孕次、產次、BMI比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，病例組孕婦有害物質接觸史、吸煙史及服用葉酸時間短于3個月比例高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2 兩組孕婦血清學和胎兒NT篩查結果及血清miR-125b、miR-124相對表達量的比較

病例組孕婦的血清學篩查陽性率及血清miR-124相對表達量高于對照組孕婦，血清miR-125b表達量低于對照組孕婦，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組孕婦胎兒NT篩查陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩組孕婦基線資料的比較

表3 兩組孕婦血清學和胎兒NT篩查結果及血清miR-125b、miR-124相對表達量的比較

2.3 血清學篩查、胎兒NT檢測及血清miR-125b、miR-124水平在DS診斷中的價值分析

ROC曲線分析結果顯示，孕早期血清學篩查及血清miR-125b、miR-124水平診斷DS的AUC均有統計學意義(P<0.05)，其中以血清miR-124a水平的AUC最高，為0.906，在Cut-off值下靈敏度和特異度分別為0.657、0.971，而孕早期胎兒NT檢測診斷DS的AUC無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖1。

表4 孕早期血清學篩查、胎兒NT檢測及血清miR-125b、miR-124水平檢測診斷DS的ROC曲線分析

3 討論

根據相關研究[7]報道，血清學篩查在孕早期對DS的檢出率相對較低，而在孕中期可達到超過75%。有一些學者提出了采用孕早中期階段性序貫血清學DS篩查來提高診斷靈敏度，減少漏篩病例[8]。也有研究[9]顯示，雖然DS早中孕期聯合血清篩查方案優于單獨早孕期血清篩查方案，但其診斷效率的差異并無有統計學意義，而且對于開放性神經管缺陷等其它先天畸形的篩查效果不佳。因此，在近年來的研究中，學者們一般主張將血清學篩查與超聲胎兒NT檢測聯合作為孕早期的DS篩查手段[10]，學術界普遍認為，這兩種方法不能互相取代，聯合應用可在一定程度上提升診斷的準確性[11]，故臨床上也將這兩種篩查方法之一提示高風險作為有創性診斷羊水穿刺的指征。本研究結果顯示，正常孕婦在孕早期胎兒NT檢測的陽性率與DS胎兒孕婦的差異并不具有統計學意義，假陰性率較高是導致該方法診斷DS效率較低的主要因素。分析其原因，可能是孕早期DS胎兒超聲軟指標表現比較多樣，胎兒的超聲表現一般以NT增厚、鼻骨發育不良、鼻骨缺如、頸后皮膚(NF)增厚為主，少數胎兒可伴有第5指中節指骨發育不良、股骨肱骨短、腎盂分離、心室點狀強回聲、草鞋足等遺傳學超聲特征,這些復雜的超聲特征易造成臨床誤診[12]；同時，相關研究[13]結果顯示，在未經強化培訓和學習的情況下，不同超聲科醫師對胎兒NT的檢測數據偏倚較大，其原因可能與測量時的胎兒體位及測量游標位置不穩定有關。因此，雖然血清學篩查和胎兒NT檢測能夠對DS篩查中發揮積極的作用，但對于輔助診斷DS的作用明顯不足，特別是可導致不必要的有創檢測及一定程度的假陽性率。

雖然DS的發病機制尚未完全闡明，但已形成了染色體配對重組異常、紡錘體組裝檢查點異常、端粒長度減少、黏連蛋白異常、卵母細胞鑲嵌選擇模型、維持DNA穩定性相關基因單核苷酸多態性等多種病理機制觀點[14]。基于這些觀點，母血中游離miRNAs作為一種新的非侵入性表觀遺傳學早期標志物被引入DS產前診斷領域，其中，針對miR-125b、miR-99a、let-7c、miR-155、miR-802等5種人類21號染色體21q21.1-21.3位點轉錄miRNAs的研究最多，這5種miRNAs參與了DS的可變表型，但DS胎兒全基因組miRNA表達的變化尚待確定[15]。miR-125b是一種廣受關注的DS 標志物，具有調節B細胞反應的作用，在DS患者人群中，miR-125b在其扁桃體記憶B細胞和血漿細胞中的表達均出現上調[16]；在DS胎兒的胎盤組織中，miR-125b表達量也會出現上調，能夠對胎盤發育相關基因發揮調控作用，從而參與DS的胎盤受損及相關妊娠病理過程[17]。進一步的研究[18]結果顯示，DS患者外周血miR-125b的高表達可能與其神經病理病變及先天性心臟病、白血病、低實體瘤等合并癥的發生率有關。然而，針對DS胎兒及其母體孕期血清miR-125b水平的研究結果則與上述結果存著明顯的分歧：例如，有研究[19]報道稱，孕婦中的細胞外miR-125b水平高于非孕婦，但其相對表達量在整倍體胎兒和DS胎兒之間無顯著的差異；同一研究團隊發表的報道[20-21]甚至得出了完全相悖的研究結論。研究結果可見，DS胎兒母體在孕早期出現了外周血miR-125b表達的下調，這種現象在先天性心臟病胎兒母體[22]和子癇前期孕婦[23]中也可觀察到。相關基礎研究[24-26]也證實，較高的miR-125b水平可對心肌細胞、視網膜神經節細胞、成骨細胞的結構和功能發揮保護作用。本研究結果顯示，DS胎兒母體孕早期血清miR-125b相對表達量下降，對于診斷DS具有一定的輔助作用。因此，孕早期母體血清miR-125b表達下調可能是DS胎兒母體孕期的重要病理機制之一，可能參與了孕期DS胎兒的器官損害過程，其確切機制尚需要相關研究予以進一步討論。

近年來關于miR-124與DS的研究并不多見，但Choi等[27]研究提示，miR-124在海馬神經發育中發揮著關鍵的作用，DS患者腦部關鍵區域中的miR-124表達異常可能促進了其認知缺陷的發生；其他研究[28-30]還報道了miR-124的過表達可提升胎盤滋養層細胞的增殖與侵襲能力、抑制干細胞成骨分化能力、影響神經干細胞增殖和分化。因此，孕早期母體血清miR-124的過表達可能提示著胎兒DS病變的神經病理過程，從而反映DS發病風險。本研究結果顯示，DS胎兒母體孕早期血清miR-124相對表達量上升，血清miR-125b、miR-124水平診斷DS的特異度較高，可用于彌補血清學篩查和胎兒NT檢測在DS篩查診斷中的特異性不足問題，這為采用孕期母體血清miRNAs檢測方法篩查診斷DS提供了有益的臨床思路。

綜上，DS胎兒母體在孕早期可出現血清miR-125b表達下調和血清miR-124表達上調，這兩種標志物在篩查診斷DS中具有較高的特異度，臨床醫師可考慮將其與傳統篩查方案進行聯合應用，以提高孕早期DS篩查的準確性。