丙泊酚介導細胞自噬及Nrf2信號通路對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

程少飛，陳娟，程晶晶

(邯鄲市中心醫院麻醉科，河北 邯鄲 056008)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)指心肌組織缺血后再次獲得血液灌注時伴隨的心肌損傷，臨床可表現為心律嚴重失常、心室功能降低、心肌梗死面積擴大[1]。隨著我國老齡化加重，冠心病、急性心肌梗死等缺血性心臟病的發生率呈逐漸增長趨勢。溶栓、經皮冠狀動脈介入手術及冠狀動脈旁路移植術治療可以幫助缺血性心臟病患者恢復心肌血液供給，但同時也會引起MI/RI損傷[2]。MI/RI損傷嚴重程度與缺血時間、側支循環情況以及再灌注條件存在密切關系，且常伴有心肌細胞凋亡和自噬過度。丙泊酚屬于鎮靜藥物，具有起效快、反應迅速和不良反應較少的特點，有良好的鎮靜、抗氧化功效，并且還能改善MI/RI損傷和腦缺血再灌注損傷[3-5]。細胞自噬屬于機體自我代謝更替的防御過程，同時也參與多種疾病發生或進展。近年研究[6]表明，全身麻醉藥物對心肌組織的保護作用可能與調節心肌細胞自噬有關。核轉錄因子E2相關因子2(nuclear transcription factor E2-related factor 2，Nrf2)信號通路在氧化應激調解中具有重要作用[7]，但有關丙泊酚與Nrf2信號通路關系的研究報道較少。本研究通過建立MI/RI損傷大鼠模型，旨在探討丙泊酚對MI/RI損傷的保護作用是否與細胞自噬、Nrf2信號通路有關，以期能為臨床緩解MI/RI損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雄性SD大鼠，體質量250～300 g[廣州中醫藥大學，許可證號：SCXK(粵)2019-0047]，于SPF級飼養環境培育：溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，晝/夜時間均為12 h，全天自由飲水、進食，購回后適應性飼養1周。本實驗均通過動物倫理委員會批準，遵守3R原則。

丙泊酚(2078-54-8，TargetMol)，CK-Mb試劑盒(QY-BM11392，上海喬羽生物科技有限公司)，Mb試劑盒(0-027530，上海江萊生物科技有限公司)，cTnI試劑盒(BS-E12272R1，廣州徠智生物科技有限公司)，乳酸脫氫酶(Lactate dehydro-genase，LDH)活力檢測試劑盒(XFE1020，上海信帆生物科技有限公司)，超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(K-F4377，上海科順生物科技有限公司)，丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)試劑盒(QC11820-B，上海欽誠生物科技有限公司)，ECL試劑盒(WB2014，上海經科化學科技有限公司)，DMSO(D2652-100ML，Sigma)，LC3-II/LC3-I抗體(ABC929，廣州東銳科技有限公司)，Beclin1、Nrf2抗體(ATA25356、ATA34138，武漢益普生物科技有限公司)，P62抗體(SPC-219D-A390-E，艾美捷科技有限公司)，HO-1抗體(bs-0827R-1，上海恒斐生物科技有限公司)，SD-001/SN-002 MinuteTM總蛋白提取試劑盒(SD-001/SN-002，英文特生物技術(北京)有限公司)。Avanti J-15R冷凍離心機(Beckman Coulter)，Primo Star iLED正置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)，R407小動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，RM2255全自動輪盤式切片機(LEICA)，SuPerMax 3000AL多功能酶標儀(上海閃譜生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備 60只SD大鼠禁食12 h后隨機分為假手術組、模型組和丙泊酚組，每組各20只。模型組和丙泊酚組采用結扎左冠狀動脈前降支方法制備大鼠MI/RI模型[8]，缺血心肌表現出發紺、膨出跡象，有兩個以上ST段抬高，T波高聳、或者QRS波增高增寬與T融合，表明心肌缺血形成。結扎30 min后松開結扎線，心電圖ST段恢復或與缺血前水平相似，表明大鼠缺血再灌注模型建立成功。剔除結扎前心電圖異常或制模過程中死亡大鼠， 其余MI/RI模型制備大鼠均制模成功。見圖1。

1.2.2 缺血再灌注 丙泊酚組心肌缺血前15 min給予靜脈輸注丙泊酚6 mg·kg-1·h-1至再灌注2 h，模型組及假手術組靜脈輸注生理鹽水3 mL·kg-1·h-1，再灌注2 h。

1.2.3 指標檢測 (1)心功能指標檢測：再灌注2 h后，采用超聲心動圖檢查各組大鼠左心室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)、左心室壁厚度(LVWT)、心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)水平。(2)心功能損傷標志物檢測：心功能心電圖監測結束后，每組隨機選取5只大鼠，取股動脈血5 mL，3 000 rpm離心15 min，取上清液儲存于-80 ℃，采用ELISA法檢測CK-Mb、Mb、cTnI水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。重復3次。(3)心肌組織HE染色：每組隨機選取5只大鼠，取心臟組織固定于10%甲醛中性溶液，常規石蠟包埋、切片(5 μm)、脫蠟、水化、蘇木精和伊紅染色、脫水、透明、中性樹膠封片后在高倍鏡下觀察大鼠心肌組織病理學變化。(4)心肌組織氧化應激因子檢測：取0.4 g心肌組織，加入4 ℃ 1 mL 0.9% NaCl溶液研磨制成組織勻漿，2 000 rpm離心10 min，取上清液存儲于-80 ℃，采用ELISA法檢測LDH、SOD、MDA水平，操作嚴格參照試劑盒說明書進行。重復3次。(5)Western blot檢測：提取心肌組織總蛋白、Bradford調整蛋白濃度至一致，經SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至PVDF膜，密封2 h，加入P62、Nrf2、HO-1、LC3-II/LC3-I、Beclin1、β-actin一抗(1∶500)，然后4 ℃孵育過夜， TBST漂洗40 min，加入經HRP標記過的二抗(1∶500)繼續孵育1 h，參照ECL試劑盒說明書進行顯影、定影，收集影像。重復3次。用UVPBio-Imaging Systems掃描蛋白質條帶，并用Image J軟件進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠心臟功能指標水平比較

與假手術組相比，模型組LVEF、FS、LVWT、HR、LVSP水平降低(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組HR、LVSP、LVEF、FS、LVWT水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心臟功能指標水平比較

2.2 各組大鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比較

與假手術組相比，模型組CK-Mb、Mb、cTnI水平升高(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組CK-Mb、Mb、cTnI水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比較

2.3 各組大鼠心肌組織HE染色

假手術組大鼠的心肌組織細胞排列規則、均勻、緊密，且心肌纖維未見明顯變性、壞死；模型組大鼠的心肌組織細胞呈散亂分布，丙泊酚組大鼠的心肌組織損傷情況較模型組明顯改善。見圖2。

2.4 各組大鼠心肌組織MDA、SOD、LDH含量比較

與假手術組相比，模型組SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平、LDH活性升高(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織MDA、SOD、LDH含量比較

2.5 各組大鼠心肌組織自噬、Nrf2信號通路相關蛋白水平比較

與假手術組相比，模型組P62、Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05)，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組P62、Nrf2、HO-1蛋白水平升高(P<0.05)，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白水平降低(P<0.05)。見圖3。

3 討論

介入治療術法是快速恢復缺血性心臟血供的重要方式之一，我國采取經皮冠狀動脈介入治療已超過40萬人[9]，該治療方式雖然可以減低復缺血性心臟病患者死亡風險，但治療時也伴有MI/RI損傷，嚴重時還可產生不可逆損傷[10]。本研究結果顯示，MI/RI損傷大鼠的HR、LVSP、LVEF、FS及LVWT水平降低，血清CK-Mb、Mb、cTnI水平升高；心肌病理結果顯示，心肌組織細胞呈散亂分布，而在MI/RI制備期間給予丙泊酚處理可以明顯緩解上述MI/RI損傷情況。MI/RI損傷可使氧自由基增多、鈣離子含量升高，線粒體能代謝出現障礙，增加心肌損傷的嚴重程度[11-12]。CK-Mb、Mb、cTnI是檢測心肌損傷的標志物，肌鈣蛋白是分布于心肌細胞內纖維上的一種調節蛋白，cTnI是肌鈣蛋白的三大亞單位之一，大部分以結合形式分布于肌原纖維上，少量以游離的形式存在于細胞胞漿，當心肌細胞膜受損時，cTnI可通過心肌細胞膜進入血液循環系統[13]。已有研究[14-15]表明，丙泊酚對老年犬MI/RI損傷時的心肌具有保護作用以及心肌再灌注損傷，與本研究結果相似，表明丙泊酚對大鼠MI/RI損傷具有改善作用。

MI/RI損傷不僅會引起心肌組織細胞結構、功能發生改變，還會引起機體的氧化應激反應[16]。本研究結果顯示，MI/RI損傷大鼠的心肌組織中的SOD活性降低，MDA水平、LDH活性升高，而丙泊酚干預可以降低MDA水平及LDH活性，提高SOD活性。正常生理狀態下的心肌細胞中含有少量的氧自由基可被自由基清除系統清除，不會對心肌細胞產生損傷。缺血缺氧時，機體自由基產生和清除系統動態平衡失調，自由基生成能力提高，自由基清除能力降低，恢復血供后可誘導自由基含量增多，提高氧化應激反應。MDA是具有細胞毒性的脂質氧化產物，LDH是能夠反應細胞膜損傷程度的糖原溶解酶。SOD活性降低時，細胞膜中不飽和雙鍵結構容易被自由基破壞，促進脂質降解產生MDA，改變細胞通透性，誘導線粒體功能障礙[17]。本研究結果說明丙泊酚對MI/RI損傷大鼠心肌損傷的改善作用，可能與降低心肌組織的過度氧化應激反應有關。

本研究結果顯示，MI/RI損傷大鼠的心肌組織中Nrf2、HO-1蛋白水平降低，而丙泊酚干預可以在一定程度上提高Nrf2、HO-1蛋白水平。Nrf2信號通路在機體抵抗外界氧化、化學等刺激的防御中具有重要作用，在機體內源性抗氧化應激系統中占據重要地位，被認為是氧化應激調控的核心樞紐。當機體收到外界有害刺激時，可刺激Nrf2活化并進入細胞核，與ARE結合并啟動ARE下游抗氧化蛋白等基因的轉錄和表達。HO-1是Nrf2信號通路中的關鍵靶蛋白，在抗氧化應激過程中具有正向調節作用。本研究結果說明丙泊酚降低MI/RI損傷大鼠心肌組織氧化應激反應，可能與調節Nrf2信號通路活化有關。此外，本研究結果還發現，MI/RI損傷大鼠心肌組織中P62蛋白水平降低，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白升高，而丙泊酚干預可以逆轉這種趨勢，P62是與蛋白質泛素化密切相關的一種泛素結合蛋白，可參與細胞信號轉導、自噬過程[18]。自噬可以促進LC3-I轉化為LC3-II，LC3-II水平與自噬體數量呈正比。Beclin1是調節自噬的關鍵蛋白之一，可通過與相關蛋白結合產生的復合體誘導細胞自噬。已有研究[19-20]表明，丙泊酚可以減輕因氧糖剝奪產生過度自噬的星形膠質細胞損傷和肝臟缺血再灌注損傷，與本研究結果一致，說明丙泊酚對MI/RI大鼠心功能保護作用可能與降低心肌組織過度自噬有關。

綜上所述，丙泊酚可以改善大鼠MI/RI損傷和心肌組織過度自噬，還能降低心肌組織氧化應激反應，可能與調節Nrf2信號通路有關，其具體作用機制還需要深入研究。