BMP-7聯合TGF-β3在誘導間充質干細胞分化中的作用

左后東

(醫學影像四川省重點實驗室，川北醫學院附屬醫院放射科，四川 南充 637000)

軟骨損傷是一種多病因、多機制導致的慢性關節疾病，以關節疼痛、變形及功能障礙為主要表現，治療不及時或治療效果不理想，最終會發展為骨關節炎，嚴重影響患者的生活質量。研究[1]表明，關節軟骨損傷是關節退變及骨性關節炎的始動環節。多種因素可導致關節軟骨損傷，如年齡、肥胖、生活環境、不合理或過量運動等。值得注意的是，由于缺乏血管和神經，關節軟骨一旦損傷則很難自行修復。目前軟骨損傷治療方法包括關節置換、軟骨移植等[2]，但這些治療方法遠期效果不甚理想，甚至會加重患者的痛苦。因此實現安全、可持續軟骨修復的同時又能保持良好軟骨功能特性就顯得意義重大，這也是目前臨床和患者的迫切需求。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有向多種細胞分化的潛能，其中包括軟骨細胞轉化[3]。研究[4-5]表明，骨形態生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)及轉化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)在軟骨發生、成熟、再生、結構完整性、軟骨內平衡等方面發揮關鍵作用。本研究擬通過BMP和TGF-β家族成員中的BMP-7和TGF-β3聯合作用，探索其在體外誘導干細胞分化為軟骨細胞和組織的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

比格犬干細胞(Cat.No.CAXMX-01001，蘇州賽業生物科技公司)，完全培養基(Cat.No.CAXMX-90011，蘇州賽業生物科技公司)，BMP-7(Cat.No.HEOPP-02102，蘇州賽業生物)，TGF-β3(ab217402，abcam，UK)，兔抗II型膠原蛋白抗體(15943-1-AP，Proteintech)，CL594標記的山羊抗兔IgG抗體(SA00006-4，Proteintech)和比格犬軟骨細胞(Cat No：DOG-iCell-s003，上海賽柏康)。

1.2 方法

1.2.1 干細胞的分化培養 在37 ℃、5%CO2和飽和濕度的條件下用購買比格犬干細胞提供的完全培養基培養比格犬干細胞。每2～3 d更換培養基，當細胞融合度達到80%左右進行傳代。收集第四代干細胞，計數干細胞(約4×104個)并移到15 mL離心管。250 g(1 200 rpm)離心4 min，之后棄上清液，用0.5 mL完全培養基清洗沉淀細胞團2次。提前準備分化培養基，在完全培養基中按照比例分別加入10 ng/mL∶10 ng/mL、25 ng/mL∶25 ng/mL、50 ng/mL∶50 ng/mL、100 ng/mL∶100 ng/mL的BMP-7和TGF-β3制成低、中、高濃度的分化培養基，分別記為低濃度組、中低濃度組、中濃度組和高濃度組；未加入BMP-7和TGF-β3的培養基作為對照組。用0.5 mL新配置的分化培養基懸浮起沉淀細胞團，隨后150 g(800 rpm)離心5 min，松開一圈離心管蓋，放入37 ℃，5%CO2和飽和濕度的培養箱中培養。48 h后，輕輕彈動離心管底部，使細胞團重懸到培養基中，每2～3 d更換分化培養基。分別于7、14、21、28、35、42 d觀察細胞團分化及成團情況。隨后拍照、4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片后檢測。

1.2.2 HE染色 將組織切片置于63 ℃烤箱中烤片2 h，二甲苯脫蠟10 min×2次，梯度酒精(100%、95%、80%、70%)依次浸泡2 min，蒸餾水洗1 min，蘇木精染色1 min，自來水洗1 min，1%鹽酸酒精分化10 s，自來水洗1 min，1%氨水返藍30 s，自來水洗1 min，伊紅染色50 s，自來水洗1 min，梯度酒精(70%、80%、95%、100%)依次浸泡1 min，吹干，中性樹膠封片。

1.2.3 阿利辛藍色染色 誘導后的細胞切片經二甲苯脫蠟10 min×2次后，再經梯度酒精(100%、95%、80%、70%)依次浸泡2 min，蒸餾水洗1 min，吸去蒸餾水，滴加阿利辛藍染液室溫染色30 min。之后用蒸餾水清洗3次，鏡下觀察，內酸性粘多糖會被染成藍色。

1.2.4 免疫熒光反應 誘導后的細胞切片脫水和脫蠟后，用PBS清洗3次，每次5 min。隨后用10%FBS，0.25%Trition X-100 的PBS封閉2 h，棄封閉液后用1/100一抗(兔抗II型膠原蛋白抗體)孵育，4 ℃，過夜。棄一抗并用PBS清洗5 min。再加入1/500二抗 (CL594標記的山羊抗兔IgG抗體)，室溫避光孵育2 h。采用購買比格犬軟骨細胞提供的培養基和方法培養比格犬軟骨細胞，在24孔板底部放置蓋玻片，每孔種植2×104個細胞，隨后在37 ℃，5%CO2和飽和濕度的培養箱中培養6 h，制作成細胞爬片。細胞爬片按上述方法進行免疫熒光染色。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞生長及聚集情況

顯微鏡下所有干細胞生長情況良好，形態正常(圖1)。對照組及不同濃度分化培養基培養的干細胞在第7天均未見細胞明顯變化，在第14天，中濃度和高濃度組干細胞聚集成團，而對照組、低濃度組和中低濃度組干細胞分散在培養基中，未見聚集成團，在第21、28、35、42天，中濃度和高濃度組聚集成團的結構大小未見明顯變化，呈乳白色膠狀，結構更為緊密，且富有彈性，三組重復實驗的結果顯示高濃度組聚集成團結構的平均直徑為(1.2±0.1)mm，大于中濃度組的(0.6±0.2)mm，而對照組、低濃度組和中低濃度組干細胞仍呈分散狀態，未見成團(圖2)。

2.2 HE染色結果

比較3種細胞的HE染色結果，可以發現誘導細胞的細胞尺寸更小，并且細胞的間隙變得更加緊密，說明細胞朝著形成致密組織的方向發生分化。而干細胞和軟骨細胞，表現出離體培養細胞的特征，即單個細胞呈長條狀，細胞之間聯系松散。見圖3。

2.3 阿利辛藍染色結果

阿利辛藍染色證明了誘導細胞的團狀結構表達豐富的酸性粘多糖(圖4)。阿利辛藍染料能將細胞表達的酸性粘多糖染成藍色。酸性粘多糖一般黏附在細胞膜上或者分泌于細胞間質，參與組織內微環境的構建。干細胞通常不表達酸性粘多糖，而軟骨細胞的表達量較高。干細胞結果為陰性，軟骨細胞和誘導細胞為陽性，且誘導細胞的藍色更深一些。可能是因為軟骨細胞分泌到細胞間隙的酸性粘多糖，在染色的過程中可能會被清洗掉。

2.4 免疫熒光染色反應

免疫熒光反應證實聚集成團的誘導細胞表達豐富II型膠原蛋白(圖5)。II型膠原蛋白的免疫熒光，干細胞亮度很弱，說明II型膠原蛋白表達很低；誘導細胞很亮，說明表達很高；軟骨細胞熒光亮度居中。推測干細胞誘導分化成的組織具有軟骨細胞表達II型膠原蛋白的特征。imageJ軟件對各組細胞的CL594通道進行定量結果顯示，誘導細胞的值為(23.211±0.816)，干細胞的值為(1.126±0.03)，軟骨細胞的值為(9.669±0.278)，各組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

3 討論

軟骨主要是由軟骨細胞和大量細胞外基質構成，其中細胞外基質包括水和富含蛋白聚糖和膠原纖維，其中以Ⅱ型膠原蛋白纖維為主。軟骨內Ⅱ型膠原蛋白纖維交聯排列成網，粘多糖和水鑲嵌其中，構成了軟骨的基本骨架。軟骨損傷在日常生活中較為常見，多種原因可導致關節軟骨損傷，如年齡、肥胖及不合理運動等。關節軟骨損傷進一步會導致關節退變和關節炎的發生[1]。而軟骨自身由于缺乏神經和血管，一旦損傷很難自行修復。

近年來，新興的軟骨組織工程研究為軟骨的修復和再生帶來了希望。許多研究[6-8]表明，骨髓間充質干細胞具有多分化潛能，可以向軟骨細胞分化并可形成軟骨組織；并且干細胞在某些因素作用和誘導下能有效的促進軟骨的再生和修復，如來自軟骨基質的水凝膠[9]，卡托原蛋白(Kartogenin)和TGF-β3[10]等。研究表明，TGF-β信號通路可能在干細胞分化[11-12]及軟骨發生、形成、結構完整性、軟骨內平衡及軟骨修復方面發揮關鍵作用[13]，這些都為軟骨修復提供了極大理論和技術支持。TGF-β信號通路是高分化、多功能性和高效性的信號網絡。TGF-β超大家族包括 TGF-βs、骨形態生成蛋白( BMPs)、生長分化因子(GDFs)、Nodal、活化素(Activin)和抑制素 (Inhibin)等成員，大致可分為TGF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS兩個亞家族。目前研究表明，后者信號通路在軟骨發生、生成及骨形成方面發揮重要作用[4，11，14]，而關于前者通路，目前研究較多的是TGF-βs因子的作用。TGF-βs 因子單獨或者與其他配體或多聚體共同作用后，能誘導和促進干細胞向軟骨細胞轉化，促進軟骨細胞的增殖，誘導細胞基質的合成及維持軟骨內環境的穩定，對軟骨損傷修復起到正調節作用[15-16]。在TGF-β亞家族中，BMP/GDF/MIS信號通路參與誘導軟骨與骨的發育形成，其中骨形態生成蛋白可以增加正常和損傷軟骨細胞基質的代謝，而細胞基質代謝的增強會替代受損軟骨細胞基質分子，從而使得BMP能夠在增強受損軟骨內在修復能力方面發揮重要作用[14]。BMP還能夠促進間充質干細胞向軟骨細胞分化及軟骨細胞的成熟和再生[17]。這種促進作用的關鍵在于其能夠促進蛋白多糖及Ⅱ型膠原的合成[18-19]，而這正是軟骨最主要的組成成分和軟骨的基本骨架。

干細胞在經過含TGF-β3的培養基培養后能展現出具有更好性能的基質產物和優于正常軟骨細胞的的修復能力，這可能與Ⅱ型膠原沉積明顯增多有關[20-21]。TGF-β3的量和培養時間也決定了修復軟骨的優良軟骨功能及生物學特性，濃度越高培養時間越長，則得到的軟骨性能更優[16]。重要的是通過TGF-β3作用再生出的軟骨內聚糖含量與正常軟骨相當，這也預示著TGF-β3可能通過調節軟骨內軟骨內聚糖 生成參與軟骨修復，同時Huang等[22]的研究也支持這一觀點，他們發現TGF-β3能極大的促進軟骨形成。此外，Chung等[23]發現，TGF-β3能進一步增強II型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖基因的上調和表達，使得誘導的軟骨具有更優越的生物學性能。而在后者的通路中，研究比較多的是BMP蛋白，其中包括BMP-2、BMP-3、BMP-7 等。研究[24-25]表明，BMP-7參與并促進軟骨的修復。Kuo等[25]采用微骨折法與 BMP-7 向聯合干預方式得到了基質更豐富、細胞分布更好的修復軟骨組織。此種修復組織具有正常比例活力細胞、軟骨下骨及軟骨礦化層，同時該組織的表面特性又得到了極大的優化，因為微骨折能大大增加修復組織的量，而BMP-7又能極大提高修復軟骨組織的質，這也正是BMP-7 和微骨折法相互協同作用的結果，說明BMP-7在軟骨修復中具有很大的潛能。同時Kim等[26]還發現，BMP-7還能與軟化的骨基質結合可刺激犬臨界大小的骨缺損中新的骨骼和血管形成，因為BMP-7不僅促進成骨還能促進產生血管營養因子。因此，干細胞能在BMP-7和TGF-β3作用下分化為軟骨組織，并可作為TGF-β信號通路中調節干細胞 轉化及軟骨細胞生成、軟骨修復的潛在靶點。

本研究發現BMP-7和TGF-β3能成功誘導干細胞向軟骨細胞分化并形成軟骨組織，并通過HE染色、阿利辛藍染色和免疫熒光證實了由骨髓干細胞分化形成的軟骨樣結構內具有豐富的聚糖和II型膠原蛋白，這與Rackwitz 等[15]研究結果相一致。同時說明BMP和TGF-βs聯合作用可以更有效地誘導軟骨形成，因此BMP和TGF-βs組合可能是體外誘導軟骨形成的重要關鍵，與Indrawattana等[27]研究結果相一致。

本研究還存在一些不足：(1) BMP-7和TGF-β3的濃度最大為100 ng/mL，未設置更高的標準；(2)由于誘導分化出的軟骨組織太小，未提取出足夠的RNA，因此沒有qRT-PCR進一步驗證；(3)缺少體內實驗驗證。針對上述不足，課題組將在后續的研究中繼續完善。

總之，BMP-7和TGF-β3聯合作用能有效的誘導骨髓間充質干細胞分化為軟骨細胞并形成軟骨組織，且濃度BMP-7和TGF-β3越高，產生的誘導效果和軟骨組織越好。