不同濃度PEBP凝膠對大鼠子宮內膜纖維化的抑制作用

黨家鳳，諶倫華，張娟，沈成義，王冰

(川北醫學院，1.臨床醫學系；2.附屬醫院婦產科；3.形態學研究所；4.影像四川省重點實驗室；5.基礎醫學院化學教研室，四川 南充 637000)

宮腔粘連，通常是在子宮刮宮術后子宮內膜基底層受到創傷所致[1]，以子宮內膜纖維化為主要特征，可導致經量減少、流產，甚至不孕。目前，宮腔粘連的主要治療方法包括術后宮腔內放置氣囊、Foley導管、宮內節育器、新鮮或凍干羊膜、硅膠片及宮腔內注射透明質酸鈉或自體交聯透明質酸鈉[2-9]。然而，大多數固體裝置無法根據不同形狀和大小的子宮腔發生適應性改變[7]，進而導致防止子宮邊緣位置粘連的成功率較低。此外，Foley導管甚至還會增加子宮內膜組織的壓力，阻礙子宮內膜的再生，誘發子宮內膜壞死[10]。透明質酸鈉或自交聯透明質酸鈉可適應不同形狀和大小的子宮腔，但卻無法長期有效。為此，設計并制備既可通過物理阻隔防止組織粘連，又可抑制成纖維細胞增殖的可被機體吸收的聚乙二醇-b-聚L-苯丙氨酸 [poly(ethyleneglycol)-b-poly(L-phenylalanine)，PEBP] 聚合物凝膠有一定的應用前景，以用于預防損傷后子宮內膜纖維化。本研究初步探討不同濃度PEBP凝膠對大鼠子宮內膜損傷所致纖維化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，鼠齡7～8周，體重220～240 g，由川北醫學院動物實驗中心提供。實驗操作均在川北醫學院實驗動物中心進行[SYXK(川)2013-076]，對動物的處置要求符合相關動物倫理學。飼養條件：室溫22～26 ℃，濕度40%～70%，損傷術后單籠飼養，可自由獲取食物。

1.1.2 手術材料 無菌干紗布(40 mm×50 mm)、醫用脫脂棉、一次性注射器、4-0可吸收縫線、6-0可吸收縫線、血管鉗、剪刀、持針器、鑷子、手術刀柄、手術刀片、止血鉗等(均采用高壓蒸汽法滅菌)。

1.1.3 主要試劑 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Sigma)、蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色試劑盒(碧云天)、MASSON染色試劑盒(碧云天)；轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)單克隆抗體(Abcam)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將24只SD雌性大鼠隨機分為4組(B、C、D、E組)，每組各6只。A組：模型組(因大鼠為“Y”字型雙子宮，造模無凝膠側隨機抽取6只子宮組織作為模型組)；B組：PEBP濃度0 mg/mL；C組：PEBP濃度8.125 mg/mL；D組：PEBP濃度16.25 mg/mL；E組：PEBP濃度32.5 mg/mL。

1.2.2 實驗造模 如研究[11]所述，采用刮宮加感染雙重損傷法建立大鼠宮腔粘連模型。將SD雌性大鼠準確稱重后，腹腔注射戊巴比妥鈉(0.69 mg/kg)麻醉，腹部備皮、仰臥位固定于手術臺上，常規消毒、鋪巾，暴露腹部手術區域。于恥骨聯合上1.5 cm 沿腹正中線向上做3 cm切口，逐層打開腹腔，暴露子宮，置于無菌巾上，雙側子宮在宮頸上方約5 mm作橫行切口，長約4 mm，對大鼠行刮宮術，宮腔四壁出現粗糙感時停止刮宮，6-0可吸收線縫合切口，將制作好的LPS棉線(4號醫用無菌手術線浸泡于6 mg/L的LPS生理鹽水中，4 ℃放置24 h)置入已行刮宮術的宮腔，生理鹽水沖洗腹腔，0.3 mL不同濃度的PEBP凝膠隨機注入大鼠的一側子宮，對側子宮注入0.3 mL生理鹽水，4-0可吸收線逐層關腹，縫合皮膚，碘伏棉球消毒傷口，48 h后取出LPS棉線。

1.2.3 取材及處理 各組均于術后第14天采用頸椎脫臼法處死實驗大鼠，立即剖腹取子宮組織，剔除脂肪及結締組織后，剪取大鼠子宮組織置于10%中性福爾馬林中固定24 h，常規石蠟包埋切片。

1.2.4 組織染色及圖像分析 高倍顯微鏡下觀察并選取視野。(1)HE染色觀察創傷組織愈合情況；(2)Masson染色觀察子宮內膜纖維化程度；(3)免疫組化染色檢測子宮內膜TGF-β1表達水平。采用Image-Pro plus圖像處理軟件收集各組數據。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠子宮內膜愈合狀況

術后14 d，各組大鼠子宮橫切面HE染色后均見豐富的內膜腺體開口，見圖1。各組間的單位面積腺體計數無明顯差異(A=27.553±19.702，B=31.625±21.714，C=24.335±15.962，D=26.500±22.346，E=31.600±19.586，F=0.467，P=0.760)，損傷組織愈合情況良好，大鼠子宮內膜因機械損傷后，誘發炎性反應，巨噬細胞的數量增多，在HE染色后大鼠子宮內膜可見巨噬細胞(圖1中箭頭所指為巨噬細胞)。

2.2 各組大鼠的單位面積纖維化比較

各組大鼠的單位面積纖維化程度分別為A=54.001±8.171、B=47.699±10.148、C=41.187±10.076、D=36.121±8.560、E=27.173±10.364(F=21.339，P<0.001)。實驗組與模型組相比，宮內植入PEBP凝膠可顯著降低損傷所致子宮內膜纖維化程度，且纖維化程度隨凝膠中PEBP含量增加而降低。見圖2。

2.3 各組大鼠TGF-β1表達結果比較

各組大鼠子宮內膜TGF-β1表達情況分別為A=0.051±0.006、B=0.067±0.005、C=0.063±0.011、D=0.057±0.017、E=0.046±0.012(F=3.119，P=0.039)。實驗組與模型組相比，PEBP含量為0的B組子宮內膜組織TGF-β1的表達顯著升高(P<0.05)，PEBP含量最高的E組子宮內膜組織TGF-β1的表達顯著下降(P<0.05)，C、D兩個PEBP凝膠組子宮內膜組織TGF-β1表達與對照組無顯著差異(P>0.05)。四個凝膠組間TGF-β1表達對比可見，TGF-β1的表達隨凝膠中PEBP含量增加而依次降低，見圖3。

3 討論

成纖維細胞是機體損傷的主要修復細胞，而成纖維細胞過度生長是纖維化形成的主要原因[12]。前期研究[13]發現，L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)可以通過調控細胞膜表面鈣離子敏感受體(calcium sensitive receptor，CaSR)實現抑制成纖維細胞過度增殖的作用。為此，本研究設計并制備了可以通過肽鍵釋放L-Phe的PEBP凝膠以用于預防損傷導致的大鼠子宮內膜纖維化，并探討凝膠中PEBP含量對纖維化抑制作用的影響。

PEBP凝膠應用于損傷子宮中可有效抑制損傷導致的子宮內膜纖維化，且纖維化程度隨凝膠中PEBP濃度的增加而降低，說明PEBP/PEG凝膠中可以抑制纖維化發生的有效成分是PEBP，這可能是由于PEBP嵌段聚合物中的聚L-苯丙氨酸鏈段，植入體內肽鍵被水解或酶解后，可釋放出抑制成纖維細胞增殖的L-Phe，從而抑制纖維化的發展。此外，與模型組相比，純PEG的B組子宮內膜組織TGF-β1的表達顯著升高， PEBP中PEG鏈段的分子量為2 kDa，B組不含PEBP的凝膠主要成分為PEG 2000及PEG 400，分子量大于2 kDa的PEG在體內的代謝主要依靠巨噬細胞的吞噬作用，而巨噬細胞也可以分泌TGF-β1，即PEG的應用刺激了TGF-β1的過度表達[14]。值得注意的是，隨著凝膠中PEBP含量的增加，大鼠子宮內膜組織的TGF-β1表達依次下降，且應用最高PEBP含量凝膠的E組TGF-β1表達則顯著低于模型組。這表明PEBP的應用可以降低組織中TGF-β1的表達。除巨噬細胞之外，成纖維細胞也是TGF-β1的主要分泌細胞，應用PEBP后TGF-β1表達的下降表明PEBP抑制了損傷組織中成纖維細胞的過度增殖。而TGF-β1作為促纖維化因子又可促進纖維化組織的形成，應用PEBP降低TGF-β1的表達可有效緩解損傷導致的組織纖維化。

綜上，PEBP/PEG凝膠可以有效抑制損傷導致的大鼠子宮內膜纖維化，源于PEBP對損傷組織中成纖維細胞過度增殖的抑制作用，并通過這一作用調控子宮內膜組織中促纖維化因子TGF-β1的表達實現抑制纖維化的作用。