含抗生素廢水的微藻處理技術及其進展

鐘雪晴，朱雅莉，王玉嬌，趙權宇

（1 南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211816；2 南京工業大學藥學院，江蘇南京211816）

抗生素在人類疾病治療和水產養殖等行業發揮著重要作用，但是抗生素過量使用也造成其在環境中累積，部分水體和土壤中均已檢測出微量的抗生素。抗生素根據結構和官能團等可以分為β-內酰胺類、磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內酯類以及林可酰胺類等。一般使用半數效應濃度（EC50）判斷抗生素的環境毒理影響。EC50值越小，代表毒性越大。環境中殘留的抗生素會影響微生物群落構成、降低土壤酶活性、影響微生物生長等[1]。抗生素通過水體和土壤進入食物鏈，最終被人類攝取，產生耐藥性。廣泛耐藥性的產生將降低人類疾病的治療效率，提高治療成本，甚至對特殊病原菌失去有效治療手段，已經成為全球威脅。亟需嚴格控制含抗生素廢水排放，切斷抗生素進入環境的途徑，保障人類健康。

目前，物理、化學和生物手段均是處理含抗生素廢水的可能途徑。一般來說，含抗生素廢水成分復雜，競爭性物質的存在降低了吸附劑對抗生素的吸附選擇性，去除效率受到嚴重影響。物理法中膜處理法由于膜污染使得通量下降，降低了處理效率[2-3]。化學法中光催化或臭氧氧化處理可能會產生其他有害中間產物，存在二次污染的風險[4]。物理法和化學法需要消耗能量將抗生素分離或降解，但是不產生附加值。生物法去除抗生素如傳統活性污泥法，其初衷是為了滿足水質排放的要求，處理后廢棄污泥的處理成本占總成本的50%～60%[5]，其他去除方法如人工濕地技術，目前還存在設計規范欠缺、濕地堵塞等問題[6-7]，所以需要探索高效、節能的方法去除抗生素。微藻能利用光能和CO2進行高效的光合作用，具有降解有機污染物、去除重金屬離子以及改良鹽堿地等潛力[8-9]。同時，微藻生物煉制可以產生有價值的副產物，如色素、脂類或生物燃料等[10]。根據國外最近的研究，微藻處理醫療廢水后干細胞質量濃度可達0.52g/L，脂含量占28%[11]。所以，基于生物煉制概念用微藻處理含抗生素廢水后，還可以獲得高附加值產品，是具有潛力的含抗生素廢水處理技術，并對實現資源循環利用具有重要意義。本文結合近年來微藻處理含抗生素廢水的部分探索性工作，重點綜述了微藻去除抗生素的機制和工藝條件。

1 含抗生素廢水的產生及其危害

抗生素在醫學、畜牧養殖業以及水產養殖業發揮著重要作用，廣泛用于預防或治療微生物感染問題[12-13]。根據全球抗生素消耗量調查結果顯示，在2000—2010 年期間抗生素藥物的消耗量從54083964813 個標準單位增加到73620748816 個標準單位，增加了36%[14]。此外，每年全球藥品和個人護理用品（PPCPs）的消耗量達到10000t。人體不能完全利用的抗生素隨生活污水進入廢水處理廠，而多數廢水處理廠不能高效處理含抗生素廢水，迄今已在國內外的地表水[15]、廢水處理廠[16]、海水[17]、地下水[18]以及飲用水[16]中檢測到微量的抗生素。部分國內外環境水體樣本中典型抗生素濃度見表1。含抗生素廢水主要來自以下幾個方面：①制藥廢水，制藥企業在藥物合成中產生的抗生素流入環境中[31]；②用藥后產生的廢水，醫療單位及養殖業抗生素的過量消耗，有一部分抗生素不能代謝，流入到城市廢水系統或河流；③廢水處理廠（WWTP）排放廢水，目前廢水處理標準沒有抗生素指標。含抗生素廢水不能通過傳統方法有效去除，而后流入到環境中[32]。Rizzo等[33]認為WWTP是環境中抗生素的重要來源。抗生素生產廢水成分復雜，處理難度大。利用微藻去除抗生素的研究多數還停留在實驗室階段，使用BG11 等常見培養基或廢水出水培養微藻，針對的也主要是面源污染問題[1]。

環境中抗生素的殘留有多方面的危害。2015年9月，我國農業部發布的2292號公告，宣布停止使用洛美沙星（LOM）、培氟沙星（PEF）、氧氟沙星（OFL）及諾氟沙星（NOR）4 種獸藥；然而，在我國部分湖泊中曾經檢測出部分抗生素，如遼河中諾氟沙星的含量高達256.03ng/L，巢湖中洛美沙星的含量達5.5ng/L，太湖中OFL的含量達82.8ng/L（見表1）。環境中存在一些固氮微生物，在增加土壤肥力方面發揮作用。而環境中殘留抗生素可能影響固氮微生物生長或者降低其在土壤的活性，這樣就需要增加化肥的使用量，造成土壤板結等問題。耐藥性基因（ARG）和耐藥菌株（ARB）的傳播，二者與難以治療的感染/疾病相聯系，造成延長住院時間和增加住院費用[1]，甚至公共健康事件。最后，人類是食物鏈的頂端，環境中的抗生素會通過營養級富集作用而使其濃度不斷升高、食物鏈的逐級傳遞而危害人體健康。如殘留在環境中抗生素可能誘發突變，對人體有潛在的毒性，嚴重可能造成致畸[34]。處理含抗生素廢水是全世界均需重視的環境問題。2015 年5 月，世界衛生大會也提出行動計劃要解決耐藥性問題[35]。需要通過合理使用抗生素、規范收集養殖污染物及優化廢水處理方法以高效去除廢水中抗生素。在多種環境樣本中均檢測到一些常見抗生素，雖然這些抗生素的檢測最大濃度在ng/L 水平，但是不能忽視其在環境中累積后的影響。表1 所示環境樣本采集自各大洲，說明水體中抗生素的潛在威脅是全球性的問題。

表1 環境樣本中典型抗生素濃度

2 微藻處理含抗生素廢水的特點

自青霉素大規模生產應用后，有效處理含抗生素廢水一直廣受關注[36]。微藻生物技術是處理含抗生素廢水的潛在方法。微藻能進行光合自養、異養和兼養，可以充分利用廢水中的氮、磷和有機小顆粒等。該技術處理廢水能減少營養物供給，處理后的藻類生物質再經提取得到有價值的副產物，形成了良性循環而吸引了研究者的目光（見圖1）。已有大量研究表明微藻能有效去除市政廢水、工業廢水、地表水、生活廢水、養殖廢水以及醫療廢水等廢水中的污染物[11,37-39]。微藻處理含抗生素廢水有以下幾個優勢：①微藻是可利用光能生長的自養型生物；②同菌相比，微藻能耐受更高濃度的抗生素[40]；③微藻不是抗生素的靶標生物，一定濃度的抗生素對微藻的生長繁殖影響較低[41-42]。抗生素在低濃度存在時能促進微藻的生長，高濃度抗生素也可能嚴重抑制微藻生長[8]，所以微藻處理含抗生素廢水也受到一定的制約。

圖1 微藻處理抗生素的流程

近年來有報道，將微藻法和其他技術相結合以增強抗生素的去除效率。如利用微藻和菌結合，系統中同時存在自養和異養代謝方式，去除有機物、重金屬及病原體的效率更高[43]。Shi 等[40]用海水小球藻處理含150mg/L 阿莫西林廢水，去除效率達85.6%±3.8%，如果微藻處理后含阿莫西林廢水繼續用潮間濕地沉積物或活性污泥處理，去除效率＞99%。在紫外光（UV）的照射下，抗生素會吸收光子進而破壞抗生素的化學鍵。Liu 等[44]用微藻和不同波長的UV結合去除頭孢他啶，結果表明短波長UV 對抗生素的去除效率更高。Li 等[45]用微藻和Fenton 反應結合去除高濃度阿莫西林和頭孢拉定，結果顯示微藻法結合Fenton 反應去除效率優于單用微藻法。活性污泥法處理頭孢拉定，去除率在22.1%～46.3%之間，單獨使用小球藻去除率可達81.4%，混合使用活性污泥及小球藻，去除效率增加到97.9%，其中活性污泥貢獻15.9%，藻類貢獻82.0%[46]。與這些技術的集成有利于提高發揮微藻生物技術的優勢以及處理含抗生素廢水的可行性。

3 微藻去除抗生素的幾種機制

3.1 生物表面吸附

抗生素在微藻表面的生物吸附即抗生素被吸附到微藻的細胞壁或者微藻分泌的胞外聚合物（EPS）上[47-48]。用滅活（熱處理過或冷凍干燥）過的微藻處理含抗生素廢水來評估微藻對抗生素的表面吸附能力[4,49]。Kiki等[50]考察了柵藻、月牙藻和小球藻處理不同抗生素時生物表面吸附的貢獻。對磺胺類抗生素生物表面吸附的貢獻僅占1%～4%，而喹諾酮類抗生素-洛美沙星（LOM）則不存在生物表面吸附，大環內酯類抗生素-羅紅霉素（ROX）、克拉霉素（CLA）及阿奇霉素（AZI）有較高的生物表面吸附。不同微藻去除抗生素時生物表面吸附的貢獻也存在藻種間差異。小球藻去除CLA、AZI及ROX 時的生物表面吸附占2%～4%，柵藻和月牙藻的生物表面吸附占6%～7%[50]。如果加入提取油脂后四尾柵藻的生物量大于2g/L，對10mg/L 四環素，3h內可以去除50%以上[51]，這主要是通過生物表面吸附去除的。微藻生物表面吸附與抗生素的親/疏水性和電荷有關，一般來說疏水性高的抗生素更容易吸附[50]。

3.2 生物降解

生物降解是微藻去除抗生素的主要途徑之一，包括胞內降解和胞外降解。

3.2.1 胞內降解

微藻胞內降解主要是通過酶催化完成的。微藻細胞內有復雜的酶系統，包括階段Ⅰ酶和階段Ⅱ酶家族[1]。首先去除以階段Ⅰ酶（細胞色素450）為開端，通過氧化、還原或水解作用脫去羥基使抗生素更具有親水性；階段Ⅱ酶如谷胱甘肽S轉移酶能催化親電子化合物和谷胱甘肽發生結合反應，這樣由于Ⅱ酶的結合使得一些環氧化合物的環斷裂而保護藻細胞免受氧化[1]。當然，在藻細胞內降解抗生素是一個復雜的過程，利用組學手段了解每一種酶在胞內生物降解過程中發揮的作用，這對藻種選擇具有重要的指導意義。 磺胺甲唑在Chlamydomonassp. Tai-03 中的降解存在3 條途徑：①與苯環相連的氨基氧化；②與苯環相連的氨基氧化以及S—N 鍵斷裂；③五元環被甲基替換，之后苯環加氫以及氨基氧化[52]，去除以前兩條途徑為主。甲氧芐啶在小球藻和雨生紅球藻等微藻內的降解途徑先后經歷羥基化、去甲基和氧化、羥基化、環的斷開以及去甲基和氧化，再經過鍵的斷開和羥基化形成降解產物[50]。

3.2.2 胞外降解

微藻會分泌成分復雜的EPS 到外部環境，EPS的主要成分包括多糖、蛋白質和脂類等[53]，而且EPS 成分復雜，隨著藻種和培養條件的不同而變化。一方面，EPS可作為水化膜使胞外酶更靠近藻細胞，進而對抗生素進行代謝[1]；另一方面，EPS可作為表面活性劑或乳化劑增強抗生素的生物利用率[1,54]，以供后續微藻將胞外的抗生素通過細胞壁運輸到微藻細胞內，在胞內對抗生素進行分解。目前，胞外降解的研究較少。

3.3 生物累積

生物累積是微藻將抗生素儲存在體內，但是并未降解。一種是微藻缺乏足夠降解該抗生素的酶，一種是酶對該抗生素的降解能力有限，導致抗生素在微藻胞內累積。生物累積在抗生素去除中的貢獻一般較小，比如磺胺美拉嗪、磺胺甲唑及磺胺單甲氧嘧啶在雨生紅球藻、羊角月牙藻和四尾柵藻中生物累積的貢獻只占2%～3%，而在小球藻中也只有4%～5%[50]。抗生素在微藻內的生物累積也與其疏水性有關，如果疏水性用n-正庚醇-水分配系數（lgKow）表示，抗生素的lgKow越高，生物表面吸附和生物累積的趨勢越大[50,55]。生物累積和生物表面吸附也可以用不同方法定量分析。生物累積和生物吸附主要有以下區別：①生物累積發生在微藻細胞內，而生物表面吸附發生在胞外[55]；②活細胞才能進行生物累積[48]。生物累積是微藻去除親脂性藥物的一個重要的機制，但是不同的藻種間存在差異。某些抗生素在細胞內的積聚可能引起活性氧（ROS）的產生，ROS對微藻細胞有雙重影響，當ROS 在常規水平的情況下，能作為信號分子控制代謝，若ROS 過量，則會對微藻合成的色素、蛋白質、脂類或DNA 造成損害最終導致微藻死亡[1]，所以，微藻只能處理一定濃度的抗生素。

3.4 光合降解

光合降解包括直接光合降解和間接光合降解。直接光合降解是某些抗生素由于暴露在光下而發生的直接分解，而間接光合降解是由于光存在而使微藻產生一些活性物質，進而對抗生素進行降解[55]。Norvill 等[56]用微藻去除廢水中四環素，監測四環素在1天（光暗周期）中濃度變化，發現間接光合降解占優勢地位。Bai 等[57]處理含二氯苯氧氯酚（TCS）廢水，發現在不加藻的情況下，7天內直接光合降解占比達到了63%～100%。一般來說，光在生物反應器中存在較強的光衰減。因此，光合降解在空間上隨著光衰減逐步降低。光合降解與抗生素種類、光生物反應器的結構和光照時間等密切相關。環丙沙星存在光合降解，白天以光合降解為主，夜晚以生物表面吸附為主[58]。對環丙沙星來說，微藻快速生長獲得足夠的生物量，通過生物表面吸附去除環丙沙星。

3.5 水解和揮發

部分抗生素在水中不穩定，會產生水解。考察其水解效果可以更準確地評價微藻在抗生素去除中的作用。無論是水解還是揮發，都和抗生素本身的物化性質和操作條件（如溫度、攪拌、pH 等）有關[48,55]。

微藻去除抗生素是一個復雜的過程，經常是多種機制都在發揮作用（見圖2）。不同的藻種去除特定抗生素的機制也存在差異。小球藻去除7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）的能力優于衣藻和麥可屬藻[59]。其中，小球藻表面吸附量最大可達4.74mg/g，光解和水解在抗生素的去除中發揮了重要作用，無光、無CO2的條件下7-ACA的去除率在75%。磺胺甲唑幾乎沒有水解和光解，主要靠衣藻的降解，水解、光解和生物降解在去除四環素中約各占50%、20%和30%[52]。微藻去除抗生素的機制研究需要從分子和生化等層面綜合分析，已經初步探索了甲氧芐啶和磺胺甲唑等抗生素的部分降解途徑，但是對抗生素在微藻體內的完整降解途徑還所知甚少[50,60]。生物表面吸附是較為快速的過程（小于1h），而生物累積和降解消耗時間較長[50,61]。這就需要考察微藻去除抗生素的動力學過程中各種機制的貢獻。

圖2 阿莫西林降解機制

4 微藻處理的工藝條件

利用微藻去除抗生素，需要根據抗生素的種類及濃度選擇適合的藻種，并優化培養條件。

4.1 藻種的選擇

總體來說，選擇的藻種要能耐受含抗生素廢水的環境脅迫，并快速生長。微藻的快速生長將獲得足夠的生物量進行抗生素的吸附、降解和累積。抗生素的去除有高度的藻種特異性。Liu 等[62]認為磺胺類、大環內酯類抗生素比四環素類及喹諾酮類抗生素更難去除；陳輝等[63]認為大環內脂類抗生素作為蛋白質抑制劑對真核微藻有更強的毒性作用；Song 等[64]用小球藻去除氯霉素衍生物——甲砜霉素，低濃度（46mg/L）去除效果最佳，去除效率為95%，并且主要是生物降解的貢獻；高濃度（159mg/L）去除效率僅為75%，其中生物表面吸附和生物累積的貢獻小于3%。Xie等[52]發現衣藻可以完全去除四環素，但是對低濃度磺胺甲唑（1mg/L）的去除率也僅有20%（見表2）。綠藻和藍藻在水生態食物鏈中是重要的一部分。已經報道的可以去除抗生素的藻種包括小球藻（Chlorellasp.）、柵藻（Scenedesmussp.）、微擬球藻（Nannochlorissp.）、衣藻（Chlamydomonassp.）、聚球藻（Synechococcussp.）等（見表2）。相對綠藻來說，多數藍藻不能耐受高濃度抗生素[69]，所以藍藻去除抗生素的研究較少。

4.2 培養條件的影響

抗生素去除與微藻生長密切相關。微藻的生長會受到光暗循環、pH、光強、CO2濃度、鹽度、攪拌速率、營養物添加以及水力停留時間等條件的影響。因此，這些因素也影響了微藻去除抗生素的效率。實驗室內優化的培養條件，在室外大規模培養及含抗生素廢水處理中未必適合。因為包括溫度、光強等這些關鍵培養條件在一天中也會產生較大的變化。需要在中試中調整相關參數，為大規模反應器參考。在室外培養過程中，水力停留時間是關鍵的參數之一[43]。對100μg/L 四環素，水力停留時間4天去除效率超過93%，如果水力停留時間增加到7 天，去除效率可以超過99%[56]。即使水力停留時間分別為1 天或2 天，小球藻在生物膜-膜光生物反應器中去除磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶以及磺胺甲唑的效率在50%～82.1%[70]。四環素等在有光和無光條件的去除機制是不同的[54]，光暗循環也是影響微藻生長的重要培養條件之一，需要對光暗循環進行優化。

光生物反應器結構決定了微藻規模化培養及抗生素去除的效率。綜合考慮廢水在實際應用情況中的問題，如總體成本、廢水量及建造問題等，開放式培養系統仍是微藻培養和廢水處理的主流選擇[71-72]。目前也有一些室外光生物反應器去除廢水中抗生素的報道。Norvil等[56]用180L室外高效藻類塘（HRAP）處理含四環素的生活廢水，雖然環境最高溫度在25.9～32.4℃之間變化，采取水力停留時間7 天或4 天，分4 個階段從5 月穩定運行到9月，可將廢水中100μg/L 四環素降低到10μg/L 以下。López-Serna 等[43]用兩個3L 開放式光合反應器處理獸用抗生素，對強力霉素和土霉素可以達到93%～95%的去除率，但是無法去除達諾沙星、磺胺二甲嘧啶和馬博沙星。Hom-Diaz 等[58]用1L 的HRAP處理在生活廢水中添加的環丙沙星，當環丙沙星濃度達到2mg/L時，也可以部分去除。如果用1200L多管式反應器處理衛生間廢水，在9～12月間采用8 天或12 天的水力停留時間，分兩個階段運行，抗生素的去除效果見表3。還需要更多的室外中試數據，考察微藻去除含抗生素廢水的技術可行性和長期操作的穩定性，并進行經濟分析。

表2 微藻處理抗生素的參數及去除效果

微藻生長需要氮磷等營養物質，除了在BG11等培養基中的探索性實驗，也有部分用含抗生素廢水或用廢水出水+抗生素的研究（見表3）。微藻處理含抗生素廢水的研究還需要和其他過程集成，將廢水中的主要指標降低到可以被微藻利用的水平，使微藻既去除氮、磷等污染物，也去除抗生素。

表3 微藻處理抗生素的參數及去除效果

5 結語

微藻生物技術是處理含抗生素廢水的可能途徑之一。光合自養型的微藻能利用廢水中的污染物，能量來源于太陽光；同時，微藻在降解抗生素等污染物的同時還能產生生物燃料等高附加值產品。然而，用微藻去除抗生素的研究還處于初期階段，存在如下問題：①微藻對實際廢水中的抗生素還無法做到完全去除；②對抗生素降解過程中的中間產物尚不明了；③缺乏規模化應用及經濟性分析。原因在于實際含抗生素廢水成分復雜與水質波動。我國幅員遼闊，氣候和水資源差異顯著。溫度和水資源等條件制約著微藻培養和含抗生素廢水處理的技術經濟性。

針對微藻處理含抗生素廢水的上述問題，還需要開展以下工作。

（1）可以篩選對目標抗生素去除能力強的微藻，結合化學、物理和生物方法，發揮各自優勢，達到去除要求。生物法中可以通過菌藻協同作用提高抗生素降解效率。需要根據抗生素降解需要，選擇合適的藻種和菌種，優化降解條件，明確菌藻之間的相互作用關系。

（2）通過組學數據等探索抗生素降解機制，綜合分析包括水解和光合降解在內的抗生素降解產物。相對大腸桿菌和釀酒酵母等工業微生物，微藻的基因組信息還不多。需要結合基因組、轉錄組、蛋白質及代謝組等組學數據精準分析微藻中的抗生素降解途徑，確認關鍵降解酶的作用及其分子機制，對有潛在危害的化合物進行監控和去除。

（3）針對實際廢水，選擇工藝并優化條件。目前的研究多數是在實驗室內進行，以去除單一抗生素為主。環境水體中抗生素的種類多，復合抗生素對藻的抑制作用可能更加明顯。需要合理選擇操作模式、反應器形式和培養條件。一般來說，面源污染中抗生素濃度低，但是微藻培養時間長，需要解決其水力停留時間問題。點源污染中抗生素濃度較高。先從較好處理的含抗生素農業廢水等做起，積累中試數據，為進一步的規模化應用打下基礎。