理肺消積丸對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長的抑制作用*

劉素曉，何慧慧，賈 瑞，杜 娟，林珊珊，劉衛紅，李 亞

(1.河南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室，河南 鄭州 450000；2.河南中醫藥大學基礎醫學院，河南 鄭州 450046)

肺癌全稱為原發性支氣管肺癌，起源于支氣管黏膜上皮及肺泡，是導致全球人類死亡的第一大惡性腫瘤，目前多以放射治療、化學治療及靶向治療為主要手段，但其副作用大，治療費用高昂，患者生活質量得不到保障[1-2]。中醫藥治療惡性腫瘤具有獨特的優勢，但對古代經典方劑的篩選、挖掘和應用還有待深入研究。近年來，中醫藥治療惡性腫瘤處于輔助治療地位，在增強患者免疫力、減少放射治療和化學治療的毒副反應、提高生活質量等方面具有較好的療效和優勢[3-4]。目前，中醫治療肺癌多以“扶正為本，祛邪為標，標本兼治”為原則，常用祛邪法有化痰逐瘀、清熱解毒、消積攻堅等[5-6]。本團隊通過對古代典籍的查閱和篩選，發現《備急千金要方·肺臟積氣》中的系列方劑多與今之治療理念不同，多用溫熱藥、寒熱并用、通補兼施。理肺消積丸正是基于此系列方藥所擬定的方劑，由人參、制烏頭、大黃、紫菀、前胡、細辛等組成，具有扶正祛邪、消積散結、攻積逐滯、消痰化痞功效[7]。其臨床療效和相關作用機制目前尚不明確，仍需進一步深入研究。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)基因編碼的蛋白兼具脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，是第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因。因此，調控PTEN蛋白的表達可作為治療癌癥的途徑之一[8]。本研究以Lewis肺癌小鼠模型為研究對象，觀察理肺消積丸對腫瘤細胞增殖、凋亡和PTEN蛋白等的影響，以期為其臨床應用提供理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

6～8周齡健康的無特定病原體(specified pathogen free,SPF)級雄性C57BL/6小鼠50只，體質量18～22 g，購自鄭州市華興實驗動物養殖場[動物生產許可證號為SCXK(豫)2019-0002]，飼養于河南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室SPF級動物房[動物使用許可證號為SYXK(豫)2017-0001]。

1.2 細 胞

標記有熒光素酶的Lewis肺癌細胞株(Lewis-luciferase,Lewis-luc)由天津市肺癌研究所提供。

1.3 藥品、試劑與儀器

理肺消積丸由人參、制烏頭、大黃、紫菀、前胡、細辛等組成，由河南中醫藥大學藥學院制劑實驗室按質量標準鑒定并制備成小蜜丸，約0.158 g/丸。使用時與水混懸，按小鼠與人的等效劑量(10丸/d)換算每日小鼠灌胃量。順鉑注射液，齊魯制藥有限公司產品，產品批號EA1A9004B。DMEM高糖培養基(產品批號12100-500)、胰蛋白酶(產品批號T1300)、蘇木素-伊紅染色試劑盒(產品批號G1120)，均為北京索萊寶科技有限公司產品；胎牛血清，Gibco公司產品，產品批號16000-044；熒光素底物，Promega公司產品，產品批號P1041；細胞增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體(產品批號10205-2-AP)、PTEN抗體(產品批號10047-1-AP)，均為武漢三鷹生物技術有限公司產品；TUNEL試劑，武漢博士德生物工程有限公司產品，產品批號MK1017。IVIS Lumina Series 3型小動物活體成像系統，PerkinElmer公司產品；CK40型顯微鏡，奧林巴斯公司產品。

1.4 動物分組、模型的建立與給藥

按隨機數字表法將小鼠分為空白對照組、模型對照組、理肺消積丸組、順鉑組和聯合組5組，每組10只。采用皮下接種法建立肺癌小鼠模型：將培養于DMEM高糖培養基(含體積分數100 mL/L胎牛血清)中的Lewis-luc細胞以胰蛋白酶消化、計數，用生理鹽水制備為1×107個/mL的細胞懸液。除空白對照外的其余4組均將上述細胞懸液接種于C57BL/6小鼠右腋部皮下，接種量為0.2 mL/只，接種后將小鼠放回飼養籠繼續飼養；空白對照組以相同方法皮下接種生理鹽水。接種1 d 后，對各組小鼠進行以下干預。聯合組：接種Lewis-luc細胞，給予理肺消積丸240 μg/(g·d)灌胃+腹腔注射順鉑0.5 μg/(g·d)。理肺消積丸組：給予理肺消積丸240 μg/(g·d)灌胃+腹腔注射等體積生理鹽水。順鉑組：給予等體積生理鹽水灌胃+腹腔注射順鉑0.5 μg/(g·d)。模型對照組：給予等體積生理鹽水灌胃+腹腔注射。空白對照組：給予等體積生理鹽水灌胃+腹腔注射。灌胃及腹腔注射1 d 1次，持續14 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 一般情況

模型制備后每隔2天固定時間觀察小鼠皮毛色澤、精神、飲食、活動等。

1.5.2 腫瘤生長情況

末次給藥24 h后，采用小動物活體成像系統觀察小鼠體內腫瘤生長情況。以戊巴比妥鈉50 μg/g體質量麻醉小鼠，腹腔注射熒光素底物125 μg/g體質量，10 min后，檢測熒光信號強度，拍照，并采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析積分光密度值。

1.5.3 腫瘤組織病理形態學情況

取小鼠腫瘤組織，以40 g/L 多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，并制備4 μm厚的切片，蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織形態學改變情況。

1.5.4 腫瘤細胞增殖情況

取小鼠腫瘤組織，以質量分數為40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，并制備4 μm厚的切片。采用免疫組化法對腫瘤組織PCNA蛋白的表達情況進行檢測；顯微鏡下觀察組織陽性染色情況，并采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽性細胞占比情況。

1.5.5 腫瘤細胞凋亡情況

取腫瘤組織，常規制備石蠟切片，脫蠟，水合，PBS洗滌，加入TUNEL染色液，封片處理，光學顯微鏡下觀察計數，并拍照。計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.5.6 腫瘤組織抑癌蛋白PTEN的表達

采用免疫組化法對腫瘤組織PTEN蛋白的表達情況進行檢測。操作方法同1.5.4。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 各組一般情況對比

空白對照組小鼠毛色光亮、精神飽滿、飲食充足。模型對照組小鼠出現毛色晦暗、形體消瘦、精神倦怠、活動減少、食量及飲水量減少等表現。各藥物組小鼠皮毛光澤度、活動量、飲食量及精神狀態等有所改善，其中以理肺消積丸組的效果較為明顯。

2.2 各組小鼠腫瘤生長情況對比

模型對照組小鼠體內熒光信號增強，腫瘤增殖明顯。與模型對照組對比，理肺消積丸組、順鉑組和聯合組小鼠體內熒光信號明顯減弱，腫瘤生長受到顯著抑制，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體內熒光信號積分光密度值對比

2.3 各組小鼠腫瘤組織病理學對比

模型對照組小鼠腫瘤細胞排列緊密，呈彌漫分布，異型性明顯，胞漿豐富，核大深染，核分裂象多見。理肺消積丸組、順鉑組及聯合組小鼠腫瘤細胞排列不規則，出現細胞空泡化、壞死情況，核分裂象減少。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理學對比(HE染色，×200)

2.4 各組小鼠腫瘤細胞增殖情況對比

模型對照組小鼠腫瘤組織PCNA蛋白表達程度高，陽性細胞比例80%以上。與模型對照組對比，理肺消積丸組、順鉑組和聯合組的PCNA蛋白表達程度均下降，陽性細胞占比明顯降低(P<0.05)。見圖2和表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織PCNA蛋白表達陽性細胞占比對比

圖2 各組小鼠腫瘤組織PCNA蛋白表達對比(免疫組化染色，×200)

2.5 各組小鼠腫瘤細胞凋亡情況對比

模型對照組小鼠腫瘤細胞凋亡率低。與模型對照組對比，理肺消積丸組、順鉑組和聯合組的細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3和表3。

表3 各組小鼠腫瘤細胞凋亡率對比

圖3 各組小鼠腫瘤細胞凋亡情況對比(TUNEL染色，×200)

2.6 各組小鼠腫瘤細胞PTEN蛋白表達對比

模型對照組小鼠腫瘤細胞PTEN蛋白表達量極低。與模型對照組對比，理肺消積丸組小鼠腫瘤細胞PTEN蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；而順鉑組和聯合組小鼠腫瘤細胞PTEN蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。與理肺消積丸組對比，順鉑組和聯合組小鼠腫瘤細胞PTEN蛋白表達量顯著下降(P<0.05)。見圖4和表4。

表4 各組小鼠腫瘤組織PTEN蛋白表達陽性細胞占比對比

圖4 各組小鼠腫瘤組織PTEN蛋白表達對比(免疫組化染色，×200)

3 討 論

中醫學中并無肺癌之病名，據臨床癥狀可將其歸屬于“肺積”“息賁”“息積”“積氣”等范疇。因肺主一身之氣，故將積氣列于肺臟，多因正氣虧損、臟腑失和、氣滯血瘀、飲食痰濁所致。內傷七情、飲食不節等均可導致氣機失司，釀生痰瘀，熱痰壅結而生癌毒，膠結成塊，而成肺積[9-11]。因此，治療應以扶正祛邪、清肺消積為主。理肺消積丸方中人參可扶正；制烏頭、大黃一熱一寒，通陽散寒；紫菀、前胡降氣止咳，燥濕化痰，消積排膿；細辛散寒逐飲，止痛鎮咳。全方共奏扶正祛邪、消痰化痞、化癥消積之效，用于治療肺積之證。本研究結果表明，理肺消積丸可明顯抑制小鼠體內腫瘤生長，改善肺癌小鼠身體及精神狀況。

腫瘤細胞無限增殖及凋亡率的持續下降是腫瘤快速生長的細胞機制。PCNA為增殖核抗原，存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞，通常用來指示腫瘤細胞的增殖狀態[12]。本實驗結果表明，理肺消積丸和順鉑的干預可明顯降低模型小鼠腫瘤細胞PCNA的表達；同時，理肺消積丸和順鉑可以顯著促進模型小鼠腫瘤細胞的凋亡。PTEN是癌癥中最常失活的抑癌基因之一，其在多種癌癥中表達均降低[13]。PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡而發揮抑癌作用[14]。本研究表明，模型對照組小鼠腫瘤細胞PTEN蛋白陽性表達率極低，理肺消積丸的干預治療可明顯提高PTEN的表達水平，而順鉑的干預并沒有使PTEN的表達水平得到明顯提高，這可能是由于順鉑通過抑制細胞DNA的復制過程而非提高PTEN蛋白的表達而發揮抑癌作用。

臨床上，采用中西醫結合的方法治療肺癌已經成為一種趨勢，且有相當一部分已經取得了較好的療效[3]；但中醫往往處于輔助治療的地位，主要針對西醫治療的毒副作用進行治療。本研究中，筆者設計了理肺消積丸與順鉑的聯合干預組，但并沒有觀察到理肺消積丸對順鉑療效有協同作用，產生這種現象的具體原因還尚不清楚，其機制仍需進一步研究。此結果提示，臨床中須謹慎或禁止理肺消積丸與順鉑類藥物的聯合應用。

綜上所述，理肺消積丸可顯著抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤的生長，其機制可能與其抑制肺癌細胞增殖、上調腫瘤細胞凋亡和PTEN蛋白表達有關，其臨床療效和作用機制還有待于進一步驗證和深入研究。