伏馬毒素B1 對小鼠血液學(xué)指標(biāo)及凋亡的影響

范 穎， 李 清， 周麗華， 賀 健， 張 熠， 寧玲忠， 蘇建明， 雷紅宇*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省株洲市農(nóng)村農(nóng)業(yè)局，湖南株洲412000）

目前， 食品和糧食安全已成為全球公共衛(wèi)生健康所關(guān)注的主要問題之一。 霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物， 既可在糧食作物田間生長時(shí)產(chǎn)生，也可出現(xiàn)在糧食作物的生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等過程中。 伏馬毒素（FB）是主要由層生鐮刀菌、 串珠鐮刀菌等鐮刀屬霉菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，于1988 年在串珠鐮刀菌液中被首次分離， 主要污染水稻、 玉米等農(nóng)作物及其衍生食品。 伏馬毒素為不同的多氫醇和丙三羧酸構(gòu)成的雙酯類化合物，性質(zhì)非常穩(wěn)定。 到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了28 種結(jié)構(gòu)類似物，可分為A、B、C、P 四類，其中毒性最強(qiáng)、 在自然界含量最多的是伏馬毒素B1（FB1）。FB1的污染范圍廣泛且較為嚴(yán)重，杜妮等（2019）在2018 年對河南、河北、江西、湖南等12省份的800 份飼用玉米、豆粕、麩皮和飼料等樣品進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)FB1的陽性檢出率為66.5%，其中玉米樣品中含量高達(dá)74.69%。 FB1具有多種毒性作用，可引起人類食管癌、豬肺水腫、馬腦白質(zhì)軟化病、大鼠肝癌等疾病（Come 等，2019；黎曉雯等，2019；蔣艷成等，2016）。本試驗(yàn)以小鼠為模型，通過觀察血液學(xué)指標(biāo)、 細(xì)胞凋亡變化等來研究FB1對小鼠的毒性作用， 以期為FB1中毒的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 40 只健康昆明小鼠，每只（20±2）g， 購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雌雄各半。

1.1.2 主要試劑 Tunel 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自博士德生物科技有限公司；總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（T-CHO）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、尿素（Urea）、肌酐（CRE）等檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑盒，購自北京天恩澤基因科技有限公司；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTM， 購自TaKaRa公司；甲醛，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 切片機(jī)（型號(hào)：RM2235），購于德國Leica 公司；電熱恒溫干燥箱（型號(hào)：202）、恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：DH-420AB），購于北京中興偉業(yè)儀器有限公司；超純水儀（型號(hào)：AFXI-0501-P），購于美國艾科蒲公司； 熒光顯微鏡（型號(hào)：Nikon Eclipse C1），購于日本尼康公司；自動(dòng)高壓滅菌鍋（型號(hào)：YXQ-LS-1851），購于博訊實(shí)業(yè)有限公司；電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)：DK-98IIA），購于天津市泰斯特儀器有限公司； 冷凍高速離心機(jī) （型號(hào)：CF16RXII），購于日本Hitachi Koki 公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：1510），購于美國Thermo 公司；核酸蛋白儀（型號(hào)：RS232C）、冷凍離心機(jī)（型號(hào)：5417R），購于Eppendorf 公司；電泳儀（型號(hào)：9162），購于北京六一儀器廠； 熒光定量PCR 儀 （型號(hào)：CFX ConnectTM），購于美國BIO-RAD 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 飼料的制備 在馬鈴薯培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)高產(chǎn)伏馬毒素的串珠鐮刀菌， 然后加入玉米碎粒中培養(yǎng)1 周， 烘干后作為玉米原料用于小鼠飼料的配制，經(jīng)檢測飼料中FB1的含量為36.82 mg/kg。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 將購買的40 只健康昆明小鼠隨機(jī)分成對照組與染毒組，雌雄各半。對照組飼喂正常飼料，染毒組飼喂含F(xiàn)B1的飼料，連續(xù)飼喂45 d。 試驗(yàn)期間保證適宜的通風(fēng)條件、充足的光照、水源和飼料，小鼠自由采食、飲水。

1.2.3 臨床癥狀和體重變化觀察 在試驗(yàn)進(jìn)行的45 d 內(nèi)，每日觀察、記錄小鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食情況、被毛和糞便等，稱量并記錄小鼠的體重。

1.2.4 樣品采集 連續(xù)染毒45 d 后， 對小鼠停止喂食12 h，然后放血處死，部分血液收集到含有抗凝劑的滅菌離心管內(nèi)用于血常規(guī)檢測，部分收集到普通滅菌離心管內(nèi)，于4 ℃靜置至血清分離，然后離心，收集上層血清用于血液生化指標(biāo)檢測。 剖檢小鼠，取肝臟、腎臟和脾臟等臟器，部分于福爾馬林溶液中固定，部分置于低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 小鼠血常規(guī)和血液生化指標(biāo)的測定 取新鮮采集的抗凝全血， 使用動(dòng)物血常規(guī)測定儀檢測白細(xì)胞數(shù)量（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)量（LY）、血紅蛋白含量（HGB）和紅細(xì)胞壓積（HCT）等相關(guān)血常規(guī)指標(biāo)。

取小鼠血清， 根據(jù)各個(gè)試劑盒內(nèi)說明書方法檢測總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽固醇（TCHO）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、尿素（Urea）和肌酐（CRE）等指標(biāo)。

1.2.6 小鼠臟體比的測定 小鼠剖殺后，將肝臟、腎臟和脾臟等器官稱重，并計(jì)算各臟器的臟體比。

臟體比/%=臟器重量/體重×100。

1.2.7 Tunel 法對小鼠脾臟凋亡的測定 將福爾馬林固定的脾臟組織按常規(guī)石蠟切片方法制作切片，取切片脫蠟入水，然后滴加新鮮稀釋的Proteinase K（與0.01 moL TBS 按1：200 的比例稀釋）于玻片上， 消化5 ～10 min。 0.01 moL TBS 洗3次，每次2 min，按每張玻片取TdT 和DIG-d-UTP各1 μL，與18 μL 標(biāo)記緩沖液混勻后加在切片上，于37 ℃濕盒中標(biāo)記2 h。 0.01 moL TBS 洗3 次，每次2 min，隨后每片玻片加50 μL 封閉液，室溫放置30 min，甩掉封閉液。 用抗體稀釋液1：100 稀釋生物素化抗地高辛抗體， 混勻后滴加50 μL 于玻片上，37 ℃濕盒中反應(yīng)30 min，0.01 moL TBS 洗3 次，每次2 min。 然后用抗體稀釋液1：100 稀釋SABC， 混勻后每片玻片滴加50 μL，37 ℃濕盒中反應(yīng)30 min，0.01 moL TBS 洗4 次， 每次5 min。待切片干燥后，中性樹脂封片，在熒光顯微鏡下觀察脾臟中細(xì)胞凋亡情況并拍照， 細(xì)胞核呈棕黃色即為凋亡細(xì)胞。

1.2.8 小鼠器官內(nèi)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的測定 取小鼠的肝臟、脾臟和腎臟組織約100 mg，研磨搗碎，使用RNA 提取試劑盒提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后以cDNA為模板，采用SYBR 熒光染料進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)，65 ℃延伸。 結(jié)果用2-△△ct法進(jìn)行計(jì)算，其中△Ct = Ct目的基因-CtGAPDH的平均值，△△Ct=△Ct-△Ct對照組的平均值， 以β-actin 為內(nèi)參基因?qū)谢虻谋磉_(dá)歸一化， 從而得出靶基因的相對mRNA 表達(dá)水平。各基因的引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS 17.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，兩組間比較為t 檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析， 結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤” 表示，P ＞0.05 表示差異不顯著，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 FB1染毒后對小鼠臨床癥狀的影響 試驗(yàn)組小鼠染毒FB1連續(xù)7 d 后，出現(xiàn)食欲下降、精神萎靡、被毛光澤下降；30 d 后發(fā)現(xiàn)小鼠排便異常，肛門周圍存在污濁物，精神萎靡、行為遲緩、體格瘦小；試驗(yàn)進(jìn)行至45 d 時(shí)，各只小鼠體型明顯瘦小、被毛雜亂，且體重顯著降低（P ＜0.01）（圖1）。

圖1 FB1 染毒后小鼠的體重變化結(jié)果

2.2 FB1染毒后對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 由表2 可知，血液中淋巴細(xì)胞百分比和淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著下降（P ＜0.05），分別下降約4.48 個(gè)百分點(diǎn)和2.98×109，血紅蛋白含量顯著減少約8.37 g/L（P ＜0.05），其他指標(biāo)無明顯變化（P ＞0.05）。

表2 FB1 對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.3 FB1染毒后對小鼠血液生化指標(biāo)的影響 由表3 可知，小鼠染毒FB1后，血液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的含量顯著上升約51.93 U/L （P ＜0.05），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的含量顯著上升約38.94 U/L（P ＜0.05）， 尿素的含量顯著上升約4.14 mmol/L（P ＜0.05）； 而總蛋白和白蛋白的含量顯著下降（P ＜0.05）， 分別下降約11.32 g/L 和5.99 g/L，肌酐和總膽固醇含量則無明顯變化（P ＞0.05）。

表3 FB1 對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

2.4 FB1染毒后對小鼠臟體比的影響 如表4 所示，與對照組相比，染毒組中脾臟的臟體比明顯下降了0.1%（P ＜0.05）， 肝臟和腎臟的臟體比無顯著變化（P ＞0.05）。

表4 FB1 對小鼠臟體比的影響%

2.5 FB1染毒后對小鼠脾臟凋亡的影響 由Tunel 法檢測小鼠脾臟細(xì)胞凋亡的結(jié)果可知，對照組中有極少量棕黃色染色的凋亡淋巴細(xì)胞， 而染毒組中可見大量棕黃色細(xì)胞， 表明染毒伏馬毒素B1后脾臟淋巴細(xì)胞凋亡顯著增多。

2.6 FB1對小鼠器官內(nèi)凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響 FB1染毒后小鼠肝臟、 脾臟和腎臟中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Fas 和P53 基因mRNA 表達(dá)量的結(jié)果見圖2。 由圖中可見肝臟和脾臟中Bcl-2 的mRNA 水平顯著降低 （P ＜0.05），Bax、Caspase 3、Caspase 9、P53 的mRNA 水平都顯著上升（P ＜0.05），且Fas 的表達(dá)量在脾臟中也顯著升高（P ＜0.05）。腎臟中僅Bax 的mRNA水平顯著升高（P ＜0.05），Caspase 3、Caspase 9 和Bcl-2 的mRNA 水平也受到影響， 但差異不顯著（P ＞0.05）。

3 討論

霉菌感染和霉菌毒素的危害是目前種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中不可避免的影響因素， 伏馬毒素B1（FB1）是一種常見的霉菌毒素，被FB1污染的農(nóng)作物、 糧食及其衍生食物會(huì)通過食物鏈的傳遞進(jìn)一步危害人類和畜禽的健康， 或降低動(dòng)物的生長性能而對養(yǎng)殖業(yè)帶來重大損失。

圖2 FB1 對小鼠器官內(nèi)凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

血液通過循環(huán)與各個(gè)器官和組織進(jìn)行物質(zhì)交換，并起到調(diào)節(jié)和防御功能。 當(dāng)機(jī)體受到外界不良刺激時(shí)， 血液內(nèi)的物質(zhì)成分和血細(xì)胞的理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變， 誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)不同程度的生理和病理變化，進(jìn)而引發(fā)組織和器官損傷（楊帆等，2020）， 因此血液學(xué)指標(biāo)與機(jī)體的器官功能、 營養(yǎng)代謝及健康狀況密切相關(guān)。 本研究對FB1染毒后的小鼠進(jìn)行血常規(guī)檢查，結(jié)果顯示血液中淋巴細(xì)胞數(shù)量、 淋巴細(xì)胞百分比及血紅蛋白含量（HGB）顯著降低（P ＜0.05）。 脾臟是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要器官， 與免疫功能密切相關(guān)， 本研究檢測小鼠的各臟器指數(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B1染毒后脾體比顯著下降，而Tunel 法檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)在染毒后FB1后明顯增多。Abbe`s 等（2016）用100 μg/kg 的FB1連 續(xù) 灌 胃Balb/c 小鼠2 周后也發(fā)現(xiàn)脾體比顯著降低，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。這些結(jié)果提示FB1對小鼠脾臟的損傷明顯，可能導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降。

霉菌毒素對動(dòng)物的靶器官主要為肝臟和腎臟（錢智勇等，2018）， 常導(dǎo)致肝臟和腎臟損傷，臨床上相關(guān)指標(biāo)發(fā)生變化。 血清中總蛋白（TP）和白蛋白（ALB）反映了機(jī)體蛋白質(zhì)吸收與代謝的程度，ALB 是TP 的組成成分，在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中合成， 在維持血漿膠體滲透壓和運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)等過程中發(fā)揮作用。 血液中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）是反映肝臟功能的標(biāo)志性酶，尿素（Urea）和肌酐（CRE）是腎臟功能的主要指標(biāo)（王利軍等，2017）。本研究檢測了FB1染毒后小鼠血液生化指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)AST、ALT、Urea 的含量都顯著升高 （P ＜0.05），TP 和ALB 的含量顯著降低（P ＜0.05），CRE 和T-CHO的含量也受到影響，這表明FB1染毒后導(dǎo)致小鼠肝臟和腎臟功能下降，可能造成損傷。 郭文博等（2015）研究中用不同濃度FB1對BALB/c 小鼠進(jìn)行灌胃處理，發(fā)現(xiàn)小鼠的采食量和體重呈降低趨勢；當(dāng)FB1作用濃度達(dá)到1.5 mg/kg BW FB1以上時(shí)，小鼠的脾臟、肺臟、腎臟顯著發(fā)生腫脹，肝臟出現(xiàn)明顯損傷，血液中性粒細(xì)胞、血紅蛋白和血小板的數(shù)量隨FB1劑量的增加而升高，且谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、總膽紅素和肌酐的濃度均顯著高于對照組。Ezdini（2020）等用100 μg/kg BW 的FB1處理BALB/c 小鼠后，血液中平均血紅蛋白濃度、平均血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積等發(fā)生顯著變化，表明血液系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)受到破壞， 且FB1處理后AST、ALT、 堿性磷酸酶 （ALP） 和乳酸脫氫酶（LDH） 等抗氧化酶活性顯著升高，TP、ALB 等指標(biāo)顯著下降。 這表明FB1染毒會(huì)影響小鼠血液學(xué)指標(biāo)，可能對器官造成損傷。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，受內(nèi)在遺傳機(jī)制的控制自動(dòng)結(jié)束生命的過程，分為線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，線粒體途徑是主要的凋亡途徑（韓笑等，2020）。促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 屬于Bcl-2 家族，其與腫瘤抑制因子P53 相互作用，在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。 Bcl-2 家族中的Bad可介導(dǎo)P53 轉(zhuǎn)移到線粒體上與Bcl-2 或Bcl-xl結(jié)合，使Bax 游離并活化（Toesca 等，2016）。 Fas屬于TNF 家族，參與死亡受體途徑，這兩種途徑激活后都要通過活化Caspase 家族從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 Zhang 等（2018）用10 μmol/L FB1染毒豬腎上皮細(xì)胞 （PK-15）24 h 后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增多，并誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷。 為進(jìn)一步探討FB1致小鼠損傷的機(jī)制，本試驗(yàn)對小鼠肝臟、脾臟和腎臟中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。 結(jié)果顯示Bax 在肝、脾、腎中的表達(dá)均顯著上升，Bcl-2、Caspase 3、Caspase 9 和P53 在肝和脾中顯著升高， 而Fas 的表達(dá)只在脾中顯著升高。Bhandari 等（2002）用2.25 mg/kg 的FB1連續(xù)皮下注射BALB/c 小鼠5 d 后， 肝臟中Caspase 3、Bax、Bcl-2 和Bad 的表達(dá)顯著增加。 這說明線粒體途徑或死亡受體途徑可能參與了FB1誘導(dǎo)小鼠脾臟發(fā)生凋亡的過程。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明， 伏馬毒素B1會(huì)影響小鼠生長狀態(tài)和血液學(xué)指標(biāo)，可能對器官造成損傷，并且還可能通過線粒體途徑或死亡受體途徑誘導(dǎo)小鼠脾臟凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致脾臟損傷，機(jī)體免疫力下降。