HPLC-PDA法測定獸用中藥液體制劑中非法添加的四種解熱鎮痛類藥物

徐 汀，張亦菲，黃家鶯，張浩然，田 愷，華賢輝，曹 瑩

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

解熱鎮痛藥是一類能使患病的發熱動物的體溫降至正常，并能緩解疼痛的藥物。這類藥物大多數對風濕病和痛風疼痛能減輕其癥狀，有一定抗炎作用，不易產生耐受性及成癮性[1]。但運用不當則不利于對患病動物的診斷從而延誤病情，同時在中獸藥中非法添加解熱鎮痛類藥物，導致養殖場在不知情的狀況下使用也會導致很多不良反應的產生[2]。因此急需一種穩定，可靠的方法來監測中獸藥液體制劑中非法添加解熱鎮痛類藥物的現象。

中獸藥作為我國傳承千年的醫藥學組成之一，是我國防治畜禽疾病的有效藥劑， 具有很好的研究應用價值[3]。而現代醫藥學研究發現，許多中草藥有效成分中所含有的物質，能夠制成的中獸藥制劑并用于動物疫病的防控，均具有激活免疫細胞的活性，調節免疫作用，增強免疫功能；又有抗病毒、抗細菌、抗氧化、抗應激及促生長之作用等[4]。中藥液體制劑是按形態分類的一大類制劑, 系指中藥提取物分散在液體介質中形成的可供內服或外用的液態制劑[5-6]。隨著禁抗時代的到來，市場上對能夠替代抗生素類產品的需求越來越大，而此時對這類中獸藥的監控也應該得到更大的關注[7]。因此，本文選擇了中獸藥中的液體制劑，在參考了相關文獻后[8-9]，結合了非法添加檢測技術的特點，建立了中獸藥液體制劑中非法添加對乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林的HPLC-PDA檢測方法，為中獸藥中非法添加解熱鎮痛類藥物的監測提供了方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平：感量0.01 mg，AB265-S，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高效液相色譜儀：Waters e2695，配二極管陣列檢測器(PDA)，沃特世公司;純水機：Molatom 1810A，中國重慶摩爾水處理設備有限公司;酸度計：PHS-3C 電位計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 試藥 對乙酰氨基酚對照品(Dr. Ehrenstorfer GmbH，批號為C15846000，含量99.9%)、安乃近對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為100002-201607，含量94.5%)、氨基比林對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100503-200301，含量100%)、安替比林對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100508-201602，含量100%)；實驗用水(電阻率>18 MΩ·bcm，符合GB/T6682一級用水的規定)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；供試品均來自抽檢樣品，為檢測合格的樣品：雙黃連口服液樣品(批號：180301)；雙黃連注射液樣品(批號20180107)；黃芪多糖注射液(批號：91801302)；益母多抗魚腥草注射液(批號：180426)；楊樹花注射液(批號：20180202)；柴胡注射液(批號：91906181)，魚腥草注射液(批號：20191001)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ S5 C18 (4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉3.0 g，加水1000 mL，用磷酸調pH值至6.5)和乙腈(84:16，V1:V2)；流速度：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μl；檢測器：二極管整列檢測器(PDA)，記錄229 nm波長處的色譜圖。取供試品溶液和對照品溶液在該色譜條件下進樣分析，同時記錄色譜圖與光譜圖。

2.2 液體的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取供試品1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容，經0.22 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備溶液 分別取對乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林對照品分別為58.68、50.73、55.80、60.40 mg 于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度線，搖勻，作為對照儲備溶液。

2.2.3 對照品工作溶液 精密量取2 mL對照儲備溶液，置20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻，經0.22 μm濾膜濾過，濾液作為對照品工作溶液。另取上述四個對照品各2 mL，一同置于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋并定容，搖勻，經0.22 μm濾膜濾過，濾液作為混合對照品工作溶液。

2.2.4 建立光譜數據庫的溶液 以對照品工作溶液作為建立光譜數據庫的溶液，建立光譜數據庫。

2.3 供試品的測定 按照2.1的色譜條件及2.2的溶液制備方法，將供試品溶液和對照品工作溶液注入高效液相色譜儀。按外標法以峰面積計算，即可得到對乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林的含量。

2.4 線性關系考察 分別精密量取“2.2”項下的對照品儲備液，將對乙酰氨基酚、氨基比林、安替比林用甲醇稀釋至10、12.5、25、50、100、200、500倍作為對照品溶液，安乃近則稀釋為至5、6.5、10、20、100、200、500倍作為對照品溶液。按照上述色譜條件進樣分析，以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標來建立線性回歸方程，結果表明，對乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林濃度分別在1.17～117.28、2.03～202.92、5.58～111.60、2.42～120.80 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系。其線性關系分別為：

對乙酰氨基酚：y=42943x-5107.1,R2= 0.9986；安乃近：y=12590x-8787.7,R2= 0.9999；氨基比林：y=22107x-15671,R2= 0.9980；安替比林：y= 25211x-468.5,R2= 0.9993

2.5 專屬性考察 取中獸藥液體制樣品，按照上述2.2的制備方法制得空白基質溶液。根據樣品使用方式選擇了比較有代表性的基質復雜的雙黃連口服液和基質比較簡單的魚腥草注射液進行專屬性實驗。通過所選擇的空白基質溶液以及對照品工作溶液進行專屬性實驗。結果表明，空白基質對四種解熱鎮痛類藥物的出峰并沒有干擾，不影響對其含量的測定。典型圖譜圖見圖1～圖3。

圖1 A為雙黃連口服液空白基質溶液的色譜圖, B 為魚腥草注射液空白基質溶液色譜圖

圖2 對乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林濃度為0.1 mg/mL對照品溶液色譜圖

圖3 對乙酰氨基酚(A)、安乃近(B)、安替比林(C)、氨基比林(D)的紫外光譜圖(0.1 mg/mL)

2.6 精密度實驗 取“2.1”項下的混合對照品溶液，連續進樣6次，計算峰面積的RSD，結果表明，對乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林的峰面積RSD分別為0.66%、1.03%、0.03%、0.10%，說明該儀器的精密度良好。

2.7 穩定性實驗 取“2.1”項下的混合對照品溶液，分別在0、1、6、9、12、24 h進樣測定6次，計算峰面積RSD，對乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林峰面積的RSD分別為0.99%、2.82%、0.18%、0.42%。結果表明，混合溶液穩定性良好。

2.8 檢測限 取中獸藥液體制劑 1 mL，逐級加入對照品儲備液2.5、2、1和0.5 mL，制成對乙酰氨基酚、氨基比林、安替比林添加量分別為2.35、1.17、0.59 g/L；2.23、1.12、0.56 g/L; 2.42、1.21、0.60 g/L;安乃近添加量為2.54、2.03、1.01 g/L的添加樣品，同樣根據樣品使用方式選擇了比較有代表性的基質復雜的雙黃連口服液和基質比較簡單的魚腥草注射液進行檢測限的考察。按照2.1的色譜條件以及2.2的處理方法進行測定。考慮到非法添加的成分含量大都較高，故選擇光譜圖失真的最大濃度作為本方法的檢測限[10]。結果表明，對乙酰氨基酚、氨基比林、安替比林的檢測限分別為1.17 g/L、1.12 g/L、1.21 g/L，安乃近的檢測限為2.03 g/L。典型圖譜見圖4～圖8。

圖4 A、B 分別為魚腥草注射液中添加(1.17 g/L、2.03 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L)和(2.35 g/L、2.54 g/L、2.42 g/L、2.23 g/L)濃度的對乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林

圖5 A、B 分別為雙黃連口服液中添加(1.17 g/L、2.03 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L)和 (2.35 g/L、2.54 g/L、2.42 g/L、2.23 g/L)濃度的對乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林

圖6 魚腥草注射液中添加的對乙酰氨基酚、安替比林、氨基比林的光譜圖(1.17 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L)

圖7 雙黃連口服液中添加的對乙酰氨基酚、安替比林、氨基比林的光譜圖(1.17 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L)

圖8 為魚腥草注射液(A)和雙黃連口服液(B)中添加安乃近的光譜圖(2.03 g/L)

2.9 樣品加標回收實驗 精密量取1.0 mL未檢出上述四種解熱鎮痛藥的供試品，置于100 mL容量瓶中，精密量取對乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林對照品儲備液1.0、2.0、1.0、1.0 mL，將其加入裝有供試品的100 mL容量瓶中。用甲醇稀釋定容，(添加水平：對乙酰氨基酚、安替比林、氨基比林為1.17 g/L、1.21 g/L、1.12 g/L，安乃近為2.03 g/L)。每份供試品做5份平行樣，按照外標法計算回收率，結果見表1，表明回收率良好。

表1 四種解熱鎮痛藥在不同中獸藥液體制劑中的回收率(n=5)

3 討論與結論

3.1 溶劑條件的選擇[11]在加標實驗中，考察了甲醇，乙腈，和流動相分別稀釋樣品進樣。結果表明，安乃近在用乙腈和流動相稀釋的樣品中回收率較差，可能是安乃近有降解。本次實驗選用的液體制劑中獸藥樣品都能在甲醇中溶解，口服液中有析出的物質對回收率并無影響。綜上，相比于流動相溶解，選擇甲醇作為溶劑可以減少安乃近的降解。

3.2 色譜條件選擇 參考了農業農村部公告第2448號上收載的阿莫西林可溶性粉中非法添加加熱鎮痛類藥物檢查方法的色譜條件，以及其他文獻中的液相色譜條件[12-13]，上述條件中，都能較好的將對乙酰氨基酚、安乃近、安替比林、氨基比林分離。但考慮到中藥制劑中基質復雜，為了能更好的將基質中的雜質和目標峰分離，所以選擇磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉3.0 g，加水1000 mL，用磷酸調pH值至6.5)和乙腈(84∶16，V1∶V2)為流動相，流速為1.0 mL/min等度進樣。

3.3 檢測波長的選擇 農業部公告 第2448號[10]上收載的阿莫西林可溶性粉中非法添加解熱鎮痛類藥物檢查方法所選擇的吸收波長為229 nm。故參考了該方法采取了229 nm作為定量波長。

上述實驗結果表明，通過高效液相色譜法檢測中獸藥液體制劑中非法添加解熱鎮痛類藥物的這一方法，具有操作方便，定量準確，重復性好的優點。為中獸藥中非法添加解熱鎮痛類藥物的監測提供了可靠的方法，為中獸藥產品的質量監管提供了保障。