利福昔明乳房注入劑(干乳期)對奶牛的安全性研究

王宏磊，陳孝杰，程雪嬌，焦曉軍，王 猛，徐 飛，陳 晨,劉義明*，李秀波*

(1.中國農業科學院飼料研究所，國家飼料藥物基準實驗室，北京 100081；2.天津中升挑戰生物科技有限公司，天津 300380；3.佛山南海東方澳龍制藥有限公司，廣東佛山 528234)

奶牛乳房炎是由于乳房無法完全抵御致病微生物的入侵和增殖而造成的乳房組織及乳頭發炎的一種常見疾病，其主要特點是乳汁發生理化性質及細菌學變化，乳腺組織發生病理學變化。在臨床上將乳房炎分為隱性乳房炎和臨床型乳房炎。乳房炎不僅造成奶牛產奶量下降、影響牛奶品質，也使奶牛過早淘汰，給奶牛養殖業帶來巨大經濟損失，嚴重困擾著奶牛養殖業的健康發展[1-3]。盡管對奶牛乳房炎進行了大量研究，但目前該疾病仍然是困擾奶牛養殖業的一大頑疾，無法根除。據報道，全球奶牛30%患有乳房炎，隱性乳房炎的患病率更是達50%以上[4]。病原菌的感染是引起奶牛乳房炎的主要因素，常見致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌，這3 種細菌引起的乳房炎占總發病率的90 %以上[5-7]。由于奶牛干乳期乳腺的抵抗力低，病原菌容易乘虛而入，干乳期是奶牛乳房炎的高發期，尤其是隱性乳房炎，難以發現，給泌乳期造成嚴重的隱患。因此,在即將進入干乳期時給奶牛用藥，能有效地預防和治療干乳期乳房炎[8-9]。利福昔明是利福霉素類衍生物，為非氨基糖苷類半合成抗菌藥[10]。其作用機制為抑制細菌多聚酶，阻斷RNA的轉錄過程，進而抑制細菌蛋白質的合成[11]。其抗菌活性強，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都有良好的效果[12]。它最初是用來防治人體局部細菌感染的藥物，并先后在意大利，墨西哥，西班牙和美國上市。利福昔明在體內不易吸收，意大利Fatro公司開發了動物用乳房注入劑、子宮注入劑和噴霧劑，用于治療奶牛干乳期乳房炎、子宮炎癥及皮膚感染。目前，利福昔明乳房注入劑(商品名Fatroximin或Fatrox)已在歐洲得到廣泛的應用[13]。國內用于干乳期治療乳房炎的藥物相對較少，為提高干乳期奶牛乳房炎的防治效果，降低養殖成本，提高養殖效益，天津市中升挑戰生物科技有限公司成功研制了利福昔明乳房注入劑(干乳期)，為干乳期奶牛乳房炎的預防和治療提供一種新的選擇。本研究考察了利福昔明乳房注入劑(干乳期)對奶牛的安全性，以期為該制劑的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 利福昔明乳房注入劑(干乳期)，包裝規格:5 mL：0.1 g，批號：120810；由天津市中升挑戰生物科技有限公司提供；推薦用藥方法：干乳期奶牛每頭牛每個乳區給藥1支。

1.2 試驗動物 參考FDA相關指導原則，實驗動物為健康泌乳期奶牛12頭，產奶量在20～35 kg/d之間。

1.3 給藥 12頭泌乳期奶牛四個乳區分別注入利福昔明乳房注入劑(干乳期)一支，給藥1次。奶牛擠奶后，先用消毒毛巾清潔各乳區，再用消毒藥液浸泡乳頭約30秒，然后進行乳頭內灌注給藥。灌注時將含藥推注管頭插入乳頭，輕輕推壓活塞，將藥物緩緩注入乳池內，隨后輕輕按摩相應乳區，使藥物均勻分布。

1.4 乳中體細胞數檢測 給藥前1 d、給藥當天(第0天)和給藥后第12小時、3、5、7、10 天，四個乳區分別采集奶樣，每次擠奶前棄掉前3把奶，用50 mL滅菌聚丙烯離心管采集奶樣，直接使用體細胞計數儀進行牛奶中體細胞數(somatic cell count，SCC)檢測。

1.5 日產奶量統計 給藥前1 d、給藥當天和給藥后第1、3、5、7、10 天統計奶牛的日產奶量。每天早、中、晚分別對每頭奶牛擠奶，每頭奶牛每次擠奶匯入專用收集桶中，稱重并記錄，統計每頭奶牛每天3次擠奶總產奶量(即日產奶量)，計算12頭奶牛的平均日產奶量。

1.6 病原菌分離鑒定 分別在給藥前0日和給藥后第10日各采集奶樣1次進行細菌學檢查。用多種選擇性培養基培養分離病原菌。將奶樣接種至選擇性培養基分離病原菌，主要分離金黃色葡萄球菌、鏈球菌(停乳鏈球菌、乳房鏈球菌)、大腸桿菌。分離菌株經純化培養后，依據菌落形態、染色特征、生化特點鑒定其種類。

1.7 直腸溫度檢查 給藥前1天、給藥當天和給藥后第12 小時、3、5、7、10 天，測量試驗奶牛的直腸溫度，觀察試驗奶牛在給藥前后體溫是否有明顯變化。

1.8 臨床癥狀觀察 整個試驗過程中，每天觀察各試驗奶牛的臨床癥狀并進行記錄。一旦出現臨床癥狀立即采取相應措施。

2 結果與分析

2.1 體細胞計數 由表1數據可知，12頭奶牛給藥前不同乳區體細胞檢測結果與給藥后各時間點奶樣中體細胞數未見顯著性差異(P>0.05)。

2.2 產奶量 由表2可知，12頭奶牛在給予利福昔明乳房注入劑(干乳期)后，與給藥前相比，各時間點產奶量無顯著變化(P>0.05)。

2.3 細菌分離鑒定 在給藥前0 d采集的奶樣中，分離的大腸桿菌、鏈球菌和葡萄球菌分別為7株、6株和9株，給藥后第10日，未檢測到大腸桿菌和葡萄球菌，僅檢測到1株鏈球菌(表3)。

表1 12頭奶牛不同乳區給藥前后奶樣中的體細胞數(萬/mL)統計

表2 12頭奶牛各時間點的產奶量(kg/d)

2.4 奶牛的直腸溫度 由表4可知，所有奶牛在給藥前和給藥后不同時間點的直腸溫度均在奶牛的正常溫度范圍內，說明按推薦劑量單次給藥對奶牛的體溫無顯著影響。

2.5 臨床癥狀觀察 12頭奶牛四個乳區分別單劑量給予利福昔明乳房注入劑(干乳期)，在整個試驗期間，給藥乳區未出現紅、腫、熱、痛等臨床癥狀。

3 討論與結論

奶牛乳房炎是奶牛養殖業中非常高發的一種疾病，能夠造成牛奶質量的急劇下降，奶牛過早的被淘汰，及治療費用的增加，給奶牛養殖業造成了巨大的經濟損失[14-15]。獸醫臨床上導致奶牛乳房炎的致病菌種類繁多，但主要的致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌[16-18]。利福昔明是半合成利福霉素衍生物，具有組織吸收水平低的特點，且對厭氧菌具有良好的殺滅效果，適合局部用藥，制成乳房注入劑直接注入乳房,能很好的發揮其殺菌作用[19-20]。關于利福昔明的安全性，國內外均有一些報道，據Borelli等[21]的報道，用大鼠和小鼠做單劑量口服急性毒性試驗，結果表明利福昔明對大鼠的LD50大于2000 mg/kg·bw，小鼠的LD50為2000 mg/kg·bw。Bertoli等[22-23]的研究表明，利福昔明以50、100 mg/kg·bw劑量口服無致畸作用。據美國FDA報道[24]，口服利福昔明100 mg/kg·bw對雄性和雌性大鼠的生育能力、胎兒產后發育及下一代生殖性能均無不良作用。任淑萍等[25]報道，大鼠每天口服利福昔明25、50、100 mg/kg，連續180 d，除雌鼠血清膽固醇呈劑量相關性增加外，無致突變、致畸及其他毒性作用。史同瑞等[26]對利福昔明混懸乳劑在豚鼠、家兔和羊上進行了安全性研究，致敏性試驗顯示豚鼠均未出現過敏性反應，皮膚刺激性試驗顯示家兔皮膚未見異常變化，黏膜刺激性試驗中僅有1只家兔的陰道黏膜出現輕微的充血現象，羊的乳腺刺激性試驗顯示羊乳房未見異常癥狀, 以上結果表明利福昔明混懸乳劑是一種安全性良好的制劑。為了評價干乳期利福昔明乳房注入劑在奶牛臨床上應用的安全性，王建等[27]對干乳期利福昔明乳房注入劑進行了豚鼠主動皮膚過敏性試驗、家兔的皮膚刺激性試驗和陰道刺激性試驗。在豚鼠主動皮膚過敏性試驗中，給藥組動物皮膚未見紅斑與水腫，在家兔的皮膚刺激性試驗和陰道刺激性試驗中，給予利福昔明乳房注入劑的試驗組和生理鹽水的對照組，兩組給藥部位的皮膚都沒有出現紅斑和水腫,在家兔的陰道刺激試驗中，試驗組和對照組的陰道黏膜沒有出現明顯的白細胞浸潤、充血和水腫現象,以上結果表明利福昔明乳房注入劑對豚鼠的皮膚不產生明顯的皮膚過敏性反應，對家兔的皮膚和陰道無刺激性。徐飛等[28]對利福昔明子宮注入劑在家兔陰道黏膜刺激性研究中也得到了類似的結論。本實驗中奶牛給藥前后不同乳區奶中體細胞數未見明顯變化，產奶量在給藥前后也未見顯著變化，12頭奶牛在給藥前和給藥后不同時間點的直腸溫度均在奶牛的正常溫度范圍內，12頭奶牛四個乳區在整個試驗期間，給藥乳區未出現紅、腫、熱、痛等臨床癥狀。結合前面王建等對干乳期利福昔明乳房注入劑進行的豚鼠主動皮膚過敏性試驗、家兔的皮膚刺激性試驗和陰道刺激性試驗結果，說明利福昔明乳房注入劑(干乳期)對奶牛無任何不良反應，安全性高。郭旭[29]對利福昔明乳房注入劑對干奶期奶牛臨床性乳房炎預防效果的實驗表明：高、中、低劑量的利福昔明乳房注入劑均能顯著的降低乳中金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌的數量，本試驗在給予利福昔明乳房注入劑(干乳期)后也得到了類似的結論，說明利福昔明能夠殺死臨床上導致奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌。

表3 實驗奶牛各時間點不同乳區奶中細菌分離情況

表4 12頭奶牛不同時間點的直腸溫度(℃)

12頭奶牛四個乳區分別單次注入利福昔明乳房注入劑(干乳期 5 mL：0.1 g)，不同時間點體溫及奶樣中體細胞數與給藥前相比未見明顯變化，奶牛的產奶量也未見顯著變化，奶牛給藥乳區未出現紅、腫、熱、痛等臨床乳房炎癥狀，與給藥前相比給藥后細菌檢出數有所降低。上述結果表明奶牛按推薦劑量單次給予利福昔明乳房注入劑(干乳期)對奶牛無任何不良反應，安全性較高。