模式生物果蠅在水環境污染物毒理學中的應用及研究進展

吳進蘭，盧晨瑛，吳明江，佟海濱

（溫州大學生命與環境科學學院，浙江溫州 325000）

0 引言

近年來，由于一些工礦企業排污設施的不健全、生態環境的破壞等原因，致使中國江、河、湖泊，甚至大海等水體污染日益加深，水中有毒、有害物質不斷增多，如：揮發性有機化合物、氟喹諾酮類藥物、重金屬、農藥和微生物毒素等。這些污染物可被植物吸收，并通過植食性昆蟲和它們的捕食者在食物鏈中積累和傳遞，從而對生態系統和人類健康造成嚴重的威脅。目前對污染物毒性監測主要采用化學分析方法，雖然簡單直接，但不能反映污染物對生物體和生態環境的潛在毒害和綜合效應。研究表明，模式生物果蠅可用來檢測污染物的生態毒理效應，是一種適合于遺傳毒性評估的模式生物[1]。

黑腹果蠅屬于雙翅目昆蟲，體長約0.3 cm，廣泛分布于除南北極外的溫帶及熱帶氣候區，目前至少有1000個以上的果蠅物種被發現[2]。果蠅具有易于飼養、生命周期短、繁殖能力強、染色體簡單、突變表型多且易于觀察等諸多優點，是科研領域最為經典、最為重要的模式生物之一[3]。此外，果蠅中的基因與人類高度同源，以果蠅為模型進行人類疾病等相關研究不僅成本低，而且不受倫理上的限制[4]。果蠅的研究已有100多年歷史[5]，早在1910年，美國遺傳學家Morgan用果蠅作為遺傳研究對象，獲得了果蠅的第一個突變體——白眼果蠅[6]。在此基礎上，Morgan提出了一個革命性的染色體遺傳理論，奠定了經典遺傳學的基礎，開創了利用果蠅作為模式生物研究的先河。

本研究通過總結黑腹果蠅應用于水環境揮發性有機化合物、喹諾酮類藥物、重金屬、農藥和微生物毒素等常見污染物的研究，突出水環境污染物對水生動物和人類的危害，以及果蠅用于毒理學研究的優勢，為今后利用果蠅研究污染物毒理效應以及抗毒機制提供參考。

1 有機污染物對果蠅毒性效應研究

苯、甲苯和二甲苯是環境中最常見的揮發性有機化合物(Volatile organic compounds,VOCs)，流行病學數據顯示，短期接觸VOCs可導致眼睛和呼吸道刺激、頭痛、頭暈、視覺障礙和記憶力受損，而長期吸入VOCs則可能損害肝臟、腎臟和中樞神經系統等[7]。在動物和細胞的研究中發現，暴露于VOCs環境下會誘導活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的過量產生，如超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫等，從而導致氧化應激的發生。在雄性小鼠模型中，VOCs可引起小鼠大腦ROS的大量產生，導致行為和學習能力降低[8-9]；在大鼠腎小管細胞中[10]，過量的ROS產生，會導致多種過激的應激反應發生，損傷不同的細胞成分，如蛋白質、基因組和線粒體DNA，以及一些膜系統。此外，一些遺傳毒性應激源不僅破壞遺傳穩定性，而且直接或間接影響基因表達[11]。Doganlar等[12]研究發現，VOCs可導致黑腹果蠅發生氧化應激，DNA突變，蛋白質破壞，以及一些與熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)和抗氧化系統有關蛋白如錳超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase,Mn-SOD)、過 氧 化 氫 酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase,GS)的轉錄和表達失調。并且Mahendra等[13]認為Hsp70、Hsp60、Hsp83和Hsp26這些應激基因的表達可以作為檢測早期細胞毒性的一種方法。此外，Mahendra還用果蠅模型測試了這些化合物的遺傳毒性和促凋亡潛能[14]，他們發現三齡幼蟲分別暴露于1～100 mM苯、甲苯或二甲苯中12 h、24 h和48 h，果蠅以濃度和時間依賴的方式顯著增加了凋亡標記物的表達和遺傳毒性。果蠅生長繁殖速度快，能夠在較短時間內在多個后代水平上，檢測污染物對其生長、繁殖、代謝等生理生化特性的影響。而對哺乳動物小鼠模型而言，獲取這些數據則需數月甚至數年以上的時間，且在實驗設備、采樣工具及操作步驟等方面比果蠅更加復雜、昂貴。因此，果蠅可作為研究苯、甲苯和二甲苯等揮發性有機化合物毒理學的合適模型，為闡明VOCs污染物的毒性機制以及遺傳毒性做深入研究。

三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是地下水中的一種氯化有機污染物，飲用水受TCE污染可能對動物和人類造成嚴重的器官損害[15]。TCE在體內的代謝主要是通過兩個不可逆的途徑。第一個途徑是細胞色素P450介導的氧化，主要產生三氯乙酸和二氯乙酸等生物活性代謝物；第二個途徑是與谷胱甘肽結合，在谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione S-transferase,GST)的催化下，形成S-1,2二氯乙烯基谷胱甘肽，并進一步代謝為生物活性突變代謝物S-1,2二氯乙烯基-L-半胱氨酸[16]。Abolaji等[17]選擇TCE對果蠅氧化應激和抗氧化標記物進行評價，結果表明，TCE能顯著提高果蠅ROS水平，抑制CAT、GST以及乙酰膽堿酯酶(Acetylcholin esterase,ACHE)活性，同時降低總巰基水平。當今，大多數氯代烴都被國際癌癥研究中心判定為致癌、致畸、致突變的“三致”物質，而果蠅具有染色體簡單、突變表型多和易于觀察，且無倫理學爭議等優點，使得果蠅在研究TCE“三致”的毒理學機制中發揮著重要的角色。

2 氟喹諾酮類藥物對果蠅的毒性效應研究

氟喹諾酮類藥物，如吉米沙星(Gemifloxacin,GE)和環丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)，是廣泛使用的一類抗生素，用于人類，牲畜、家禽和魚類養殖，最終可通過多種途徑排放到環境中，包括制藥工業的殘余水、醫院廢物、污水處理廠以及養殖場的廢水和糞便廢物的土地都檢測到它的存在。研究調查發現，國內水生環境中已經大量檢測到氟喹諾酮類抗生素[18]，其中，CIP是廢水處理廠廢水含量最高的藥物，并且已經證明CIP可導致魚類在早期生命階段出現形態異常[17]。2019年美國食品和藥物管理局報道氟喹諾酮會嚴重損害人體細胞，可能導致多個器官出現嚴重損傷[20]。Aslan等[21]探討了GE對黑腹果蠅存活率、發育及成蟲壽命的影響。結果發現，GE對果蠅幼蟲、蛹和成蟲的發育都有不良影響。較低濃度的GE能延長黑腹果蠅雌雄成蟲的壽命，但在最高濃度的GE可降低其壽命。Liu等[22]通過測定CIP對果蠅的不同用藥時間(48 h、72 h、96 h)的LC50值，證明了CIP可導致果蠅個體壽命縮短，發育遲緩，較多幼蟲未能化蛹或孵化。Bidell等[23]指出需要進行更多的研究，以闡明氟喹諾酮類藥物的毒性作用。而果蠅具備成熟的研究技術，完整的基因組測序，最重要的是，在基因結構和功能上與包括人類在內的高等動物極為相似，可更好地闡明氟喹諾酮類抗生素在生態和人類健康方面所造成的潛在危害提供科學依據。

3 重金屬對果蠅的毒性效應研究

重金屬鎘是環境中一種特別常見和嚴重的污染物，普遍存在于土壤、空氣和水中。鎘因具有劇毒效應和未知的生理作用而特別受關注[24]。鎘處理果蠅細胞株誘導熱休克蛋白合成增加，可能與鎘毒性導致DNA損傷和蛋白質合成干擾有關[25]。果蠅細胞經鎘暴露后，可以取代金屬酶中的鋅，并與其他蛋白質的自由巰基相互作用，導致蛋白質合成減少以及細胞死亡。Giaginis等[26]討論鎘對DNA修復過程的抑制作用，包括核苷酸切除修復、堿基切除修復和錯配修復，鎘可以替代DNA修復著色性干皮癥A組蛋白(Xeroderma pigmentosum group A,XPA)中鋅指結構中的鋅，從而導致變形和失活[27]。Hu等[28]檢測了鎘對果蠅的生殖力、GST和ACHE的活性以及防御相關基因(Hsp70、Gstd2和Gstd6)的表達。研究發現鎘顯著延長了雌性的交配潛伏期，并減少了產卵量，但對雄性生殖力沒有影響[29]。鎘通過直接和間接的毒性作用對果蠅的生長發育的損傷，導致果蠅的化蛹時間和羽化時間延長，蛹化率和羽化率顯著降低，表明果蠅有潛力成為鎘污染監測的指示生物。

鉛也是一種常見的有毒污染物，可對人體的健康產生不利影響。鉛進入人體會損傷細胞器和重要的蛋白質[30-31]，包括新陳代謝所需的酶，最終導致人體認知受損、免疫力下降和心血管系統缺陷。Nanda等[32]以果蠅為模型發現進食鉛后的果蠅出現蛹化率降低且蛹化時間延長，死亡率增加，這可能是因為鉛誘導果蠅全身DNA損傷。在鉛環境中生長的果蠅幼蟲體長較小且有小黑斑，表明攝入鉛后的果蠅血細胞數量減少和酚氧化酶(Phenol oxidase,PO)活性降低。在果蠅、斑馬魚和小鼠等模型生物的研究中，已經闡明了鉛暴露導致細胞蛋白合成過程中斷的機制，但鉛的毒性影響也可能是跨代的，因此果蠅在科學評估鉛毒性及其長期危害中具有其獨特的優勢。

甲基汞(MeHg)是由水生沉積物中的厭氧微生物介導汞甲基化而產生的，它可以在水生食物鏈中積累，是一種高毒性環境污染物，對中樞神經系統危害極大[33]。Le?o等[34]研究發現，暴露于甲基汞中會導致果蠅的存活率、發育率以及運動能力下降。甲基汞與硒醇基團結合緊密，可用作甲基汞解毒劑[35]，然而研究人員發現硒化合物二苯二硒并不能阻止甲基汞對黑腹果蠅的毒性作用，反而導致其對果蠅的毒性增強。近年來利用果蠅作為研究影響人類神經系統疾病的分子機制已經有了很多的報道[36-37]。果蠅保留了與人類共同的代謝通路，并且有越來越多的證據表明果蠅晝夜節律[38]調節機制和學習記憶[39]過程與人類相似。因此，果蠅和哺乳動物暴露于甲基汞可能會導致類似的生理變化，這提示果蠅也可作為研究甲基汞神經毒性的良好模型。

氯化汞(HgCl2)是一種廣泛應用于農業和醫藥的重金屬化合物，是一種危害動物胃腸、腎臟、肝臟和神經元等組織的環境污染物[40]。其毒性主要歸因于汞結合并抑制某些抗氧化因子的能力，從而導致有害活性氧的過量產生。果蠅中腸的結構組織和功能與哺乳動物具有相似性，可以作為研究汞中毒對消化系統的影響[41]。Chen等[42]發現HgCl2主要積累在果蠅中腸內，攝入HgCl2的果蠅中腸內ROS局部過量產生，凋亡的上皮細胞增多。與中腸相比，對汞毒性易感的大腦沒有觀察到明顯的細胞死亡和活性氧生成，這可能是因為大腦受到其它類型的損傷并沒有被檢測出來。利用果蠅探討汞污染對動物以及人類的腸道和神經的影響，將為系統研究汞對動物和人類的遺傳毒理及生物學效應提供依據。

銅是所有生物體必需的微量元素，是多種酶結構和催化功能所必需的重要輔助因子。但農藥、殺菌劑以及工業廢物的過度生產使用，使得二價銅(Cu2+)成為嚴重的環境污染物[43]。在大腦中，Cu2+的毒性可導致海馬和額葉皮層的氧化應激、谷氨酸興奮性毒性、凋亡和星形細胞增多，以及學習和記憶受損[44]。飲用水中的低濃度Cu2+可能會導致哺乳動物的神經毒性，影響認知，并與許多神經退行性疾病的發病機制有關[45]。在生理水平上，果蠅幼蟲期暴露在Cu2+環境中會降低存活率并延緩發育，同時降低成蟲體重、生殖力和存活率[46]。Klimaczewski等[47]發現，Cu2+喂養的果蠅在負向趨地性能方面有損害，死亡率升高，并且ACHE和GST活性顯著降低，抗氧化酶如Sod、Cat、硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase,Trxr1)和核因子E2相關因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)的mRNA水平顯著升高。由此可知，Cu2+對果蠅的生長發育都存在一定的毒副作用。另外，Zamberlan等[48]研究了Cu2+對雌雄成蟲發育和學習記憶的影響，發現暴露于Cu2+中，幼蟲、蛹和成蟲的死亡率增加，成蟲的記憶力下降，并且雄性果蠅比雌性果蠅更容易受到Cu2+毒性的影響。近年來，重金屬等環境化學物質污染在世界范圍內引起了廣泛關注，而銅做為人體必需的微量元素，其污染帶來的潛在危害往往會被忽視。重金屬Cu2+進入河流、土壤，不能被生物降解從而累積在動植物體內，最終通過食物鏈進入人體。因此研究重金屬Cu2+潛在的危害以及深入的毒性機制至關重要。果蠅具有獨特的生理優勢，在研究重金屬Cu2+對人類潛在的危害中將發揮重要的作用。

4 農藥對果蠅的毒性效應研究

阿特拉津(Atrazine,ART)是一種用途廣泛的除草劑，也是一種常見的環境污染物。動物接觸ART可能會影響發育、繁殖和能量代謝[49]。在一些體內和體外模型中，ART可誘導氧化損傷、細胞毒性和凋亡，最后導致神經、肝和腎損傷[50]。有研究發現，ART與多種代謝途徑密切相關，ART暴露(5 mg/kg)可顯著改變小鼠血漿代謝物的分布[51]，而ATR（250 mg/kg和500 mg/kg）暴露14天具有免疫系統毒性，表現為脾臟細胞數量、脾臟重量和胸腺重量顯著下降[52]。Fernanda等[53]研究了ART對黑腹果蠅胚胎和幼蟲發育過程中存活率和氧化還原代謝的影響，發現ART降低了果蠅的蛹化率和羽化率，但沒有改變果蠅的發育時間和性別比，他們還發現ART可導致果蠅活性氧生成增加、抗氧化能力減弱，從而造成氧化損傷。此外，ART還降低了果蠅抗氧化基因（Keap1、Sod、Sod2、Cat、Irc、Gss、Gclm、Gclc、Trxt、Trxr-1和Trxr-2）的轉錄水平。以上研究表明，ART能夠誘導黑腹果蠅在胚胎和幼蟲發育過程中抗氧化防御相關的基因表達譜的改變，導致氧化應激損傷。此外，Figueira等[54]對果蠅胚胎和幼蟲發育期間的行為和多巴胺能神經傳遞進行了評估。當分別給予10 μM和100 μM ART暴露時，雌蠅表現出靜止時間的增加和探索活動的減少。多巴脫羧酶和多巴胺受體的基因表達也僅在ART暴露的雌蠅中增加，但對雄蠅均無顯著影響。他們認為阿特拉津對雌性果蠅的行為效應是由于多巴胺系統的紊亂造成的。ART暴露是生殖、代謝和神經系統疾病的潛在風險因素，但其毒性機理尚未深入闡明。

除草劑-二嗪農中有四種最常見的活性成分，即阿特拉津、二溴季銨、氟氮磷對丁基和麥草畏。二嗪農是一種廣泛用于傳統農業的有機磷殺蟲劑，已在地下水、農業井、飲用水井和監測井中檢測到。美國環境保護署的一項研究發現了兒童尿液中存在二嗪農代謝物。除了主要的神經毒性，二嗪農與氧化應激和血管毒性等密切相關[55]。為了深入了解二嗪農氧化應激損傷以及行為缺陷，Chaudhuri等[56]利用果蠅模型誘導其氧化應激，發現與未暴露的果蠅相比，二嗪農降低了果蠅成蟲的負向趨地性反應、跳躍行為和運動節律。這項研究結果表明，二嗪農中的成分是通過競爭性結合到保護酶的活性部位，誘導氧化損傷，從而導致果蠅運動行為缺陷的發生。除草劑種類以及濃度的不同，效果也不同。Aguiar等[57]對草甘膦或基于草甘膦的除草劑對果蠅氧化應激、抗氧化防御系統以及ACHE活性研究發現，草甘膦會導致果蠅體內早期抗氧化防御系統的激活，防止ROS對機體的損害。噻蟲嗪(Thiamethoxam,THIA)是一種用途廣泛的農藥，但其對昆蟲生長發育的影響尚不清楚。Li等[58]發現THIA在致死劑量范圍內可延長果蠅生長發育所需時間，降低果蠅的繁殖力、化蛹率、羽化率和壽命。此外，THIA還引發果蠅DNA損傷，降低脂肪體細胞和血細胞的活性。這些研究結果都為進一步研究水中殘留農藥的危害提供了依據。農藥帶來的水體污染已經危害到動物以及人類的健康，迫切需要研究阿特拉津、二嗪農和噻蟲嗪等常見的污染物的潛在毒性及其機理。果蠅是評價農藥生物毒性的一種優秀的生物模型，已被用作毒理學試驗的有效工具。

5 微生物毒素對果蠅的毒性效應研究

副溶血性弧菌是一種發現于受污染海產品中的腸道病原體，通常是在食用受污染的海鮮之后，出現胃腸炎癥狀，包括嘔吐、腹部痙攣和腹瀉[59]。在致病過程中，副溶血性弧菌分泌的效應蛋白抑制宿主的先天免疫信號通路，從而使細菌逃避先天免疫系統的識別[60]。副溶血性弧菌分泌的一種效應蛋白(Vibrio parahaemolyticus,VopA)，通過絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPKs)催化結構域中關鍵殘基的乙酰化，對MAPKs信號通路具有抑制作用。果蠅中腸和哺乳動物腸道的生理相似性和發育相似性決定了果蠅是研究人類腸道疾病的理想模式生物[61]。利用果蠅模型，Luo等[62]發現VopA的抑制活性在果蠅中仍然存在，VopA對粘著斑復合物(Focal adhesion complex,FAC)有很強的調節作用，并能顯著降低粘著斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)Ser910位點磷酸化水平，而FAK的Tyr397和Tyr861兩個酪氨酸位點磷酸化水平顯著升高。此外，VopA可以破壞果蠅中腸上皮細胞的排列，擾亂腸道穩態，以促進副溶血性弧菌在宿主體內感染的機會。了解腸道上皮細胞與致病微生物之間緊密的物理、遺傳和生化的相互作用，一直是腸道種群科研人員的研究目標。果蠅中腸的結構以及遺傳學的保守性，有利于進一步闡明人類腸道微生物群和疾病發生發展之間的相互作用。

6 展望

隨著經濟社會的不斷發展，空氣污染、生態破壞與水體污染情況愈發嚴重。水體富營養化、海洋污染等問題頻發，水生動植物以及人類的健康受到了嚴重的威脅。水體中的重金屬、有機物、農藥等會擾亂生物體的氧化機制和神經系統，造成嚴重的損傷，如改變GST和ACHE兩種酶的活性以及防御相關基因的表達，生殖能力、行為能力、生存能力和學習能力降低等。而目前對污染物毒性監測主要采用化學分析方法，比如重金屬可采用試劑比色法、原子熒光法和X射線熒光光譜法等分析方法；根據不同的農藥類型選擇氣相色譜法、液相色譜法以及GC-MS-MS等通用型檢測技術，但這些化學方法并不能評估污染物對動植物以及人類的危害。作為一種經典的模式生物，有關果蠅的生物學知識和實驗工具已大大超過了其他的模式生物，利用果蠅模型可快速檢測及篩選水環境污染物中的毒性化合物。并且，人類與果蠅的遺傳背景高度保守，也使得果蠅成為研究人類疾病的最佳模型之一。與其他模型生物相比，果蠅具有壽命短、成本低、遺傳物質簡單的特點，利于人們觀察污染物對果蠅表型的影響并探討其機理；其生長周期短和飼養成本低則有利于人們進行大批量的毒性研究，也有利于進一步深入開展抗毒藥物的研發。此外，果蠅大量的基因工具可用于探討污染物的遺傳毒性和機制研究。當然，以果蠅為模型進行毒理研究有一定的局限性，由于果蠅是低等昆蟲，與人類相比，在很多方面依舊有很大的區別，但如果能很好的利用其自身優勢，筆者認為利用好模式生物果蠅可能會為水體污染物對人類潛在毒理危害的相關研究提供新的思路。