產纖維素酶菌系的添加對厭氧干發酵產沼氣的影響

張 陳，閆紅心，紀 棟，魏志豪，姚志松，CAMARA ZOUMANA，蘇有勇

（昆明理工大學農業與食品學院，昆明 650500）

0 引言

根據英國石油公司2020年統計年鑒顯示，2019年可再生能源消費總量只占一次能源消費量的4.9%，而其中的生物質燃料消費總量占比更微乎其微[1]。中國作為全球農作物秸稈第一生產大國，據統計2002年全國農作物秸稈為6.2億t[2]，而2005年的產量增至8億t[3]。同樣的，人民生產消費能力的提升也帶動了畜牧業的迅猛發展，僅2015年中國僅奶牛養殖就有約1200萬頭，隨之而來的是每年產生大量的牛糞，但利用率低[4-5]。盡管近年來政府出臺了很多限制秸稈焚燒政策，但是還有大量秸稈仍然以不同形式的形式燃燒，而燃燒所帶來的是大量的氣體污染[6-8]。農作物秸稈和牛糞是一類含豐富纖維素類的生物質能源，而纖維素是一種由β-D吡喃葡萄糖通過1-4糖苷鍵組成的無支鏈結構[9]，由木質素和半纖維素結構包裹而很難被利用[10-11]。目前的學者大多圍繞著如何破環木質纖維素之間的交聯結構開展相關課題，主要是圍繞著物理法，化學法和生物法或者三者之間共同作用等手段達到破壞纖維素結構的目的。微波法是物理法常用的方法之一，Sapci Z[12]使用微波預處理秸稈，產氣量沒有明顯提高。而化學法通常是添加酸堿試劑、微量元素或離子液體等手段破環纖維素結構。He等[13]添加6%的氫氧化鈉預處理水稻秸稈，使產氣率有所提高，而且通過處理后的樣品結構來詳述化學試劑對秸稈處理的影響。生物法主要是酶法進行預處理秸稈樣品，Wang等[14]通過微生物產生的纖維素酶預處理秸稈樣品，使沼氣產率提升36.9%。這些方式各有利弊：物理法和化學法作用快，但是對設備要求高且對環境不友好，而生物法作用緩慢且成本高，但是基本不會產生對下游工藝有害的化學物質。相比較而言，通過向發酵體系中直接添加高產纖維素酶菌系能持久穩定的降解纖維素，并可能與原發酵體系中的菌群形成物質能量代謝平衡，以期獲得針對纖維素原料一類物質的高產氣量發酵體系。并且厭氧干發酵是一種高效、環保，且對設備要求相對較低的處理方式。本試驗通過將玉米秸稈和牛糞按照一定比例混合進行厭氧干發酵，希望通過添加篩選得到的高效產纖維素酶復合菌系，從而能高效利用原料中的纖維素產沼氣，緩解當前環境污染并且解決當前能源危機。

1 材料與方法

1.1 材料

牛糞收集自云南省昆明市附近養殖場，新鮮牛糞用保鮮袋封口備用；秸稈購于江蘇東海某農產品生加工廠，粉碎長度在0.5 cm左右；纖維素菌株分離來源于河南牧田生物科技公司和農富康公司；接種物取自昆明理工大學農業與食品學院農業環境與能源工程研究室的活性污泥。具體原料特性見表1。試驗于2020年7—12月在中科院微生物研究所進行。

表1 原料特性

1.2 培養基

篩選培養基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，Tryptone 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂15.0～20.0 g/L。

LB(Luria-Bertani)培 養 基 ：NaCl 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，Tryptone 10 g/L。固體培養基需要加瓊脂15.0～20.0 g/L。

1.3 試驗裝置

批量發酵試驗裝置為本實驗室自制沼氣發酵裝置，具體裝置如圖1所示。主要分為發酵裝置和和集氣裝置組成。發酵裝置是由500 mL塑料瓶組成，瓶口連接一個放氣閥和一個導氣管，導氣管連至集氣裝置。儲氣采用排水集氣法，儲氣瓶外側粘有經過標定的刻度線，用作讀取產氣量。

圖1 批量試驗裝置示意圖

1.4 試驗方案

1.4.1 產纖維素酶菌種篩選 將所購的產纖維素酶菌樣按照固液比1:10加入無菌蒸餾水，放置于30℃恒溫搖床200 r/min搖勻2 h制成菌懸液。將菌懸液梯度稀釋涂布至CMC-Na初篩培養基，菌株長出后重新再初篩培養基上劃線純化。將單菌落按照兩點法接入CMCNa培養基，利用剛果紅浸染法對初篩的產酶菌株進行復篩。根據透明圈大小選擇高產纖維素酶菌株構建復合菌系。對篩得的菌株進行分子生物學鑒定，利用引物27F和1492R擴增16rDNA。PCR產物送測序公司測序，再與EZbiocloud數據庫(www.ezbiocloud.net)進行比對，初步鑒定菌株。

1.4.2 復合菌系構建 參考前人的試驗方案[15]，首先將菌株接入LB液體培養基，選取一株菌涂滿LB固體培養基，其余菌株用濾紙片浸潤后按照圖2的示意圖貼于固體培養基表面。選擇生長互不影響的菌株構建成復合菌系。

圖2 拮抗試驗示意圖

1.4.3 發酵試驗 本試驗總發酵體系為200 g，總發酵固體物含量(TS)為20%，接種物含量為30%，用沼液補足質量。復合菌系中的菌株按照1:1的比例，總發酵體系1%的比例接入發酵體系。本次試驗設置2個不加復合菌系的對照組和不添加發酵原料的空白組。具體物料添加表見表2。發酵溫度在沼氣發酵能正常產氣的前提下，按照復合菌系正常的生長溫度設定，故本次發酵溫度設定為37±1℃。測定發酵啟動前和發酵結束測定發酵體系的TS、揮發性固體(VS)和pH，過程中測定每日沼氣產量，甲烷比例。由于發酵總固體物含量較高，每日兩次搖勻發酵瓶。由于空白組產氣極少，實際計算中未考慮其產氣量。

表2 發酵物料配制

1.5 測定指標及方法

物料的TS和VS的測定參考文獻[16]；pH的測定使用pHS-3C酸度計測量；產氣量根據儲氣罐上的之前標定的刻度確定；甲烷測定使用島津GC-14B氣相色譜測定，檢測條件為柱溫50℃，進樣口溫度為80℃，檢測器溫度為130℃。

2 結果與分析

2.1 降解纖維素菌株篩選

初篩純化后獲得18株降解纖維素菌株，具體菌株編號見圖3。根據剛果紅浸染CMC-Na培養基后通過透明圈的大小確定6株具有較高纖維素降解能力的菌株，然后通過分子生物學方法對其進行鑒定，復篩的培養基圖如圖4所示，具體的6株菌株編號和鑒定結果見表3。

表3 菌株編號及其鑒定結果

圖3 降解纖維素菌株初篩

2.2 復合菌系構建

根據篩選到的6株菌按照圖2的方式進行拮抗試驗，試驗結果如表4所示，可以看出(ZC-1,NF-4)，(NF-3,NF-4)，(ZC-3,NF-4)，(NF-3,YJ-2)，(NF-3,YJ-5)，(NF-4,YJ-2)等菌株組合之間是沒有拮抗作用的，結合圖4中透明圈大小的結果，選擇(NF-3,NF-4)組合作為復合菌系。

圖4 降解纖維素菌株復篩

表4 菌株之間拮抗結果

2.3 復合菌系的添加對產氣量的影響

每日測得的沼氣量取平均值作折線圖，每日的沼氣量累計作折線圖，如圖5所示。可以看出不加復合菌系的對照組和添加復合菌系的試驗組前期日產氣量曲線基本類似，發酵第一天產氣量達到頂峰后迅速下降。但是發酵中期對照組產氣量緩慢上升，在發酵第13天達到最大值，然后緩慢下降至發酵結束。而試驗組在前期達到頂峰后產氣降為0 mL。試驗組發酵中后期產氣量一直穩定在100 mL左右。

圖5 日產沼氣量和累計沼氣產量折線圖

日產甲烷量和累計甲烷產量如圖6所示。試驗組和對照組前期產甲烷曲線類似，發酵中期對照組出現產甲烷高峰，最高日產甲烷量達到72.8 mL，之后逐漸回落。而試驗組在發酵周期前半段甲烷產量低于對照組，待對照組進入發酵后期，試驗組日產甲烷量才穩步提高，在第19天日產甲烷量達到高峰，為70.2 mL。

圖6 日產甲烷量和累計甲烷產量折線圖

對照組和試驗組的發酵周期分別為20天和28天，總產氣量分別為2.4 L和3.0 L，累計甲烷產量分別為543.7 mL和845.1 mL。添加復合菌系使產氣量提高了25%，甲烷產量提高了55%。

2.4 復合菌系的添加對產氣率的影響

產氣率一般能體現物料作為發酵產氣的好壞標準之一，而池容產氣率能體現發酵池綜合產氣效率。計算對照組和試驗組的原料產氣率和平均池容產氣率繪制柱狀圖（圖7）的分析可知，試驗組的原料產氣率分別為86.4 mL/gTS和111.4 mL/gVS均比對照組提高了21.3%，而平均池容產氣率略低于對照組，降低了14%。

圖7 產氣率和平均池容產氣率柱狀圖

3 討論

3.1 研究的優缺點及優化方向

纖維素是農作物秸稈的主要成分之一，為了對其進行資源化利用，首先就要解決其轉化成可溶性糖的效率，而其被木質素和半纖維素包裹而難以分離是主要的難點之一[22-25]。木質素和半纖維素結構沒有纖維素結構那樣具有單一單體以單一形式的化學鍵連接排列的規律結構，所以使用化學法和物理法對其破壞遠比生物法效率高[26-27]。趙晨等[28]詳細對比各種預處理方案，總結出NaOH預處理從效果和成本考慮均是最佳，預處理7天使得原料產氣率達到225 mL/gVS，產氣量提高450%。而本試驗在最優條件下的原料產氣率也僅有111 mL/gVS，雖然高于對照組，但低于一般以餐廚廢棄物或綠色植物等為發酵原料的產氣率，這也可能與原料實際特性和干發酵的特點所致[17-19]。基于此次試驗方式為干發酵，對空間利用率一般會高于正常的濕式發酵，由于本實驗原料為難以發酵的纖維素類原料，所以綜合來看，平均池容產氣率基本與一般文獻報道的結果類似[20-21]。從結果來看不論是以什么方式進行預處理，對厭氧發酵產沼氣性能均有一定的促進作用，如果考慮成本、對環境的影響、對下游的處理成本等因素來考慮，很多預處理方式差強人意。生物法相對于化學法而言的優勢體現在對環境友好，對設備要求低。對廢棄物的處理若是以犧牲環境為代價便得不償失。

生物法預處理主要是利用降解纖維素菌株產的纖維素酶預處理或者與化學法等其他手段耦聯預處理原料，再進行厭氧發酵產沼氣。趙肖玲[29]詳細對比了酶法預處理、菌液預處理、不同酶不同比例和兩種方法混合預處理對秸稈發酵產沼氣的性能的影響，結果得到混合酶預處理效果優于菌液預處理，而兩種方法混合預處理優于單一方法預處理的結論。這種酶法預處理僅將纖維素降解為可溶性糖，實質與可溶性糖類原料發酵無異。而本試驗擬解決的主要問題是希望通過篩選出高效降解纖維素類原料的菌株構成復合菌系，利用篩選得到的復合菌系添加至發酵體系，希望能夠與原發酵體系中的發酵菌群達到共生體系。利用產纖維素素酶類添加至發酵體系，不僅對原料進行降解，而且參與到厭氧發酵產沼氣循環中，相當于增加了發酵三階段中的第一階段途徑，使得物質能量之間代謝循環得以增強。與前人對比發現，未來所要解決的是如何縮短發酵周期，提升產氣效率。其中一個方向是如何篩選到更適合發酵體系的復合菌系，復合菌系比單一菌株更能適應環境，更能提供多種不同的組合酶[30]。另一個方向是對接種物的馴化，利用原料馴化復合菌系使之更適應原料，從而來提高產沼氣性能。朱繼英等[31]和席江等[32]給出不同的觀點，但都提出利用原料馴化接種物對菌群結構有影響的結論。

3.2 研究的意義

21世紀以后，眾多以高科技為核心的清潔能源如核能、太陽能、海洋能等在科技的帶動下如雨后春筍般發展，尤其是政府成功的結合某些貧困地區的特點而提出的光伏脫貧模式，這為太陽能產業錦上添花[33-34]。近年來沼氣行業似乎成為“夕陽產業”，大中型沼氣項目原料來源不穩定，中小型項目效益低下，沼氣下游能源轉換技術不成熟，沒有政策扶持等一系列問題擺在從業者面前[35-36]。正如前文所提到的，厭氧發酵產沼氣不僅能解決能源短缺，另一個重要的方向是解決廢棄物處理問題，從而帶動農業和畜牧業的健康循環發展。如今隨著農業和畜牧業的機械化自動化的普及，在原料的獲取上越來越有利，如何將這些資源有效利用，并以環境治理為特色是今后科研工作者要解決的重要難題。

4 結論

試驗經過初篩得到18株能夠降解纖維素的菌株，經過剛果紅浸染復篩得到6株具有較高纖維素降解能力的菌株。根據拮抗試驗篩選到最佳的復合菌系組合為 (Bacillus siamensis, Bacillus subtilis subsp.Stercoris)，該復合菌系能共存且二者產纖維素酶能力較強。厭氧發酵產沼氣試驗中，復合菌系的添加主要影響發酵中后期的產氣，能夠明顯提高沼氣產量和甲烷產量，對原料的產氣率也有一定促進作用，但是延長了發酵周期，降低了平均池容產氣率。