基于DNA甲基化調控的中醫藥防治動脈粥樣硬化的研究進展*

肖 婷，何貴新，秦偉彬，莫霄云，林 琳，鄧學秋，陳天宇，任加以，玉黎燕，申永艷

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530299；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530022）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病常見的發病基礎，發病機制復雜，不僅與多基因遺傳相關，也受環境因素影響，盡管以調脂、抗血小板凝聚防治動脈粥樣硬化的治療方法不斷推進，但防治效果往往不理想，而中醫藥在臨床治療中具有多靶點和全方位的作用特征，新近研究發現中藥單體成分和復方通過作用于DNA甲基化可有效治療AS[1]。隨著現代研究技術的發展，從分子生物學角度研究中醫藥對動脈粥樣硬化關鍵靶標的甲基化調控作用也越來越受重視，這也有助于進一步闡釋動脈粥樣硬化發病機制、疾病風險評估及發現早期診斷的新的分子標志物，同時還能為疾病治療提供新的途徑。DNA甲基化的調控作用研究已成為生命科學中普遍關注的前沿領域。本文對近年來相關研究進行如下綜述。

1 DNA甲基化

1.1 DNA甲基化：潛在的診斷標志物或治療靶點DNA甲基化是一種已被廣泛研究的表觀遺傳調控機制，是后基因組時代生命科學領域的重要組成部分，在基因轉錄中扮演著重要角色。DNA甲基轉移酶（DNA methyltransterase，DNMT）的催化作用下激活胞嘧啶-磷酸鳥嘌呤雙核苷酸序列分布呈現高度密集狀態的基因CpG島，利用S-腺苷甲硫氨酸作為供體，將DNA甲基基團轉移到胞嘧啶和鳥嘌呤（CG）二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上，并與其3'端的鳥嘌呤形成mCpG，導致DNA結合蛋白與DNA主螺旋溝的結合能力降低，發生DNA甲基化，使某些區域DNA構象變化，阻止轉錄因子與啟動子結合，進而在不改變基因構造的前提下，造成基因轉錄過程受到抑制，使基因“沉默”。DNMTs是一種主要在大腦中存在的酶，DNMT家族在DNA甲基化修飾過程中起到了非常重要的調控作用，當前發現中，DNMTs家族中主要是DNMTI、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C和DNMT3L，但只有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B具有甲基轉移活性[2]。如果在啟動子區域發生DNA甲基化，導致染色體結構不穩定甚至構象發生變化、轉座子異常表達或基因表達活性下降甚至喪失[3]。

近年來，隨著DNA甲基化檢測技術的不斷發展和完善，人們逐步認識到差異性DNA甲基化在基因調控、蛋白質表達、胚胎發育、個體生長中起重要作用，并且在各系統疾病中的研究也已得到認可。DNA甲基化修飾通過多種途徑調控特定基因的表達，維持細胞結構的穩定性。反之，一旦甲基化修飾過程中的任何一個環節出現異常，相應疾病也隨之出現[4]。大量的研究表明，DNA異常基因甲基化與人類衰老、心腦血管疾病、代謝異常疾病、各種腫瘤等關系密切，DNA基因甲基化是上述疾病發生發展的一個早期事件，并貫穿于整個疾病發生發展過程[5-6]。因此，可以通過檢測DNA基因的異常甲基化作為篩查疾病的生物標志物，更好為疾病找到具體的治療靶點提供依據，為后期藥物開發提供參考。

1.2 DNA甲基化在動脈粥樣硬化中的作用 動脈粥樣硬化（AS）是一種由多病因引起的慢性炎性疾病，以內皮細胞損傷、脂質浸潤、血管平滑肌細胞發生遷移和增殖為主要特征，累及心腦等重要器官，是心腦血管疾病發生的主要因素[7]。但是關于AS的發病機制尚不完全清楚，主要觀點為AS是由多種因素共同作用的結果，包括血流動力學改變、脂質代謝異常、血管內皮損傷、物理化學因素及遺傳因素等[8]。當前，基于AS發生發展的“炎癥”和“脂質沉積”學說而開發的抗炎和降脂藥物已成為臨床上治療AS的基石。然而，單純的藥物抗炎和降脂作用越來越有限，而且一些患者已經表現出耐藥性。因此，需要探究AS發生發展更深層次的影響機制調控過程，尋找能夠為臨床提供更加有效的預防AS的方法。隨著現代分子生物學、基因組學及表觀遺傳學技術的快速發展，疾病的治療已不只局限于通路靶點的研究，而擴展到微觀分子水平。當前表觀遺傳學的調控作用成為新的治療靶點和熱點，AS機制研究也取得一些進展。研究[9]發現，AS中出現異常DNA甲基化的異常表達，在AS的斑塊形成、調控單核/巨噬細胞、血管內皮細胞（endothelial cell，EC）和血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）功能及AS的病變程度等中均具有重要的功能。目前很多研究發現，基因DNA甲基化的改變與AS關系密切。DNA甲基化通過調節某些被甲基化區域的基因表達和血管平滑肌細胞的分化，從而影響AS的形成。對AS相關基因甲基化的研究已成為當今熱門趨勢，AS的發生發展是多個基因甲基化及不同基因不同甲基化水平聯合作用的結果。迄今為止，主要是關于雌激素受體相關基因、免疫相關基因、成纖維細胞生長因子、脂質相關基因及其他影響因素的研究。具體如下：

1.2.1 DNA甲基化參與平滑肌細胞增殖 雌激素在未絕經婦女中具有保護心血管的作用，原因是雌激素激活后，使一氧化氮合酶基因表達上調，可以很好地抑制血管平滑肌增殖和遷移，具有抗動脈粥樣硬化作用，也與調節脂質代謝有關。有研究表明，AS患者體內雌激素受體基因的啟動子CpG島存在高甲基化現象，造成基因沉默，使其抗AS作用降低或喪失[10]。另外有研究發現，HILTUNEN M O等[11]在新西蘭兔的動脈粥樣斑塊及增殖的血管平滑肌細胞中發現，其基因組的甲基化水平較正常對照組普遍降低，同時發現基因組平滑肌細胞增生明顯，影響AS病變的發展過程。HUANG Y S等[12]研究發現，AS患者的雌激素受體啟動子區發生甲基化為水平70.4%，而正常對照組僅為28.6%。可以證實的是，異常的DNA甲基化水平參與血管平滑肌細胞的增殖和遷移，進而影響動脈粥樣硬化斑塊的形成。

1.2.2 DNA甲基化參與脂質形成AS主要因膽固醇的長期積累，血小板凝集，發生粥樣改變。有研究表明[13]，AS患者體內白細胞中的三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1基因啟動子序列存在異常的高甲基化狀態，介導細胞內膽固醇和磷脂流出并轉運至載脂蛋白A-1（apolipoprotein-1），使血漿中高密度脂蛋白及膽固醇水平增高，證明了三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1基因高甲基化參與脂質代謝，從而與AS的形成具有密切關系。

1.2.3 DNA甲基化調控炎癥反應AS是以巨噬細胞浸潤，T細胞異常和血管內皮功能受損為主要特點的多病因慢性炎癥反應。AS可以導致血管的阻塞、心肌梗死、外周血管疾病、動脈瘤和腦梗死等疾病[14]。AS的發生及發展與異常基因甲基化關系密切，而這些異常基因甲基化包括異常的高甲基化與低甲基化。基質金屬蛋白酶9是一種重要的炎癥介質和細胞外基質代謝酶，當其發生異常高表達或者活性增強時，會影響AS病變進展過程，甚至出現急性惡化。研究[15]表明，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者基質金屬蛋白酶9基因啟動子區域甲基化水平明顯低于正常對照組，該濃度也顯著升高，這提示基質金屬蛋白酶9基因參與AS的形成機制。賈鐳等[16]研究發現，調節性T細胞（Treg）在抑制AS的形成和進展中具有重要作用，隨著冠狀動脈粥樣硬化病變程度加劇，Treg水平也顯著降低。LI Z B等[17]研究表明，micro RNA-223基因低甲基化與腦梗死密切相關，在23例腦梗死患者中進行microRNA-223基因啟動子甲基化水平，結果顯示，與健康組比較，腦梗死患者microRNA-223基因啟動子甲基化水平明顯降低。近期研究發現，micro RNA-223基因在AS等疾病中扮演重要角色。

1.2.4 DNA甲基化參與AS相關危險因素 同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是AS的獨立危險因素之一，通過損害血管內皮細胞、刺激平滑肌細胞增生、血脂異常及血管的氧化應激反應，對AS血管病變造成影響，成為心血管風險指標之一。研究證實，當體內缺少維生素B及葉酸時，血漿中的Hcy水平升高[18]。LI J J等[19]研究表明，高水平Hcy能降低AS患者體內的總甲基化，參與炎癥介導引起的血管內皮損傷。另外一項研究也證實了這一點，SHARMA P等[20]檢測137例冠心病患者和150名健康人外周血總DNA甲基化，發現冠心病患者總DNA甲基化水平明顯高于健康人，且與Hcy水平呈正相關。此外，吸煙是心血管疾病的重要危險因素。ZHANG Y等[21]指出，吸煙與DNA甲基化密切相關，引起DNA甲基化的變化，使基因表達異常，參與疾病的發生，增加心血管疾病的全因死亡率。

2 DNA甲基化的“微觀”表象是中醫學研究的切入點

近年來，關于DNA甲基化的研究思路被逐漸應用于中醫藥研究中，表觀遺傳學的“微觀”研究已成為中醫學研究的切入點，包括用于從微觀角度解釋中醫證候、中醫經典理論、中藥的作用機制等方面。

2.1 “天人相應”與DNA甲基化 用現代科學語言來闡釋中醫藥理論是非常困難的，這也是困擾現代中醫藥研究者的一大難題，隨著表觀遺傳學的發展及應用，為中醫藥傳統理論提供了新的解讀。中醫學將人體與外部環境看成一個整體，即“天人相應”，天人相應與中醫學的整體觀密不可分。中醫注重整體辨證施治，主張“天人合一”，在《易經》中[22]有“夫大人者，與天地合其德，與日月合其明，與四時合其序，與鬼神合其吉兇，先天而天弗違，后天而奉天時，天且弗違，而況于人乎”的論述，指出人不能與天道相違，要順應自然。《三因極一病證方論》中提出“內因、外因、不內外因”致病學說，均著力于人先天之質與后天之邪產生疾病的關系。研究[23]發現，對雌性幼鼠進行高糖牛奶飲食后，成年后可導致高胰島素血癥和肥胖，并且這些表現型可以遺傳給它的子代，但是通過相應的飲食控制就可以再次改變，甚至可以在子代中得到預防，說明表觀遺傳學是可逆的。表觀遺傳學強調遺傳因素和環境因素相互作用，與中醫學對人體內外環境整合同一的重視，二者的理念漸趨一致，方法各異，可以互相借鑒，共同發展。這也是中醫的整體治療觀和單靶點療法在疑難雜病治療中比較，前者更具令人興奮的療效原因所在，也突出中醫學對疾病認識的科學性。

DNA甲基化與地域密切相關。如《素問·五常政大論篇》明確指出：“一州之氣，生化壽夭不同，其何故也?歧伯曰：高下之理，地勢使然，崇高則陰氣治之，污下則陽氣治之。陽勝者先天，陰勝者后天，此地理之常，生化之道也。……高者其氣壽，下者其氣夭，地之小大異也，小者小異，大者大異。”不同區域內的氣候條件、地理環境、起居飲食習慣等因素對于生活在該區域內的人和生物有著不同的影響，使該區域內所有的人具有某些共同的體質特點，這些體質特點又進一步決定了該區域內群體的病理變化傾向。這些體質特點、病變規律和治療方法就是這種群體特征與天相應的反映所在。通過研究[24]發現，對60例母親妊娠早期經歷過荷蘭饑荒所生的孩子與兄弟姐妹比較，發現胰島素樣生長因子2甲基化區域位點存在顯著差異。這也說明了環境的變化可以造成基因甲基化修飾的變化，這也與中醫學因地制宜的觀點不謀而合。

2.2 “陰陽自和”與DNA甲基化《素問·上古天真論篇》記載：“上古有真人者，提挈天地，把握陰陽，呼吸精氣，獨立守神，肌肉若一，故能壽敝天地，無有終時。”中醫藥治療主張調和陰陽，治病所求的根本即在于“陰陽”。陰陽是是對自然界相互關聯的某些事物或者現象對立雙方屬性的概括，在構建中醫學理論體系、形成中醫學思維模式中發揮了不可替代的作用。從微觀角度看，陰陽失調的部分現代生物學基礎在于DNA甲基化的失控（包括異常的高甲基化與低甲基化），通過調控基因的轉錄及其表達水平，“損其有余，補其不足”，使之重新恢復平衡狀態，是謂《素問·至真要大論篇》中“謹察陰陽所在而調之，以平為期”。中醫陰陽自和的理論為治療心血管疾病提供了新的思路，也將為中醫學“治病求本”的研究開辟了新的方向。

《素問·生氣通天論篇》云：“凡陰陽之要，陽密乃固。兩者不和，若春無秋，若冬無夏。因而和之，是謂圣度”“內外調和，邪不能害”，陰陽是相對的，可以相互轉化。陰陽的相互轉化是事物發展的又一過程，在一定的條件下可以向其各自相反的方面轉化，即陽可以轉化為陰，陰也可以轉化為陽，“物極謂之變”就是這個道理。《黃帝內經》把重和極概括為是引起陰陽轉化的“拐點”，醫生要準確地認識、把握和利用陰陽轉化的“拐點”，從而有效地防止疾病惡化，或使已經惡化的病情得到逆轉，這種陰陽轉化規律是廣泛存在的。表觀遺傳方面的可逆性和轉化性，如組蛋白在組蛋白乙酰基轉移酶（HATs）作用下發生乙酰化，而在組蛋白去乙酰化酶（HDACs）作用下又可以出現去乙酰化，乙酰化是組蛋白的重要修飾方式，受HATs和HDACs的共同調控，這一特性與陰陽轉化之間的關系具有異曲同工之妙。現代研究[25]發現，異常的高甲基化與低甲基化基因之間的共存模式是眾多疾病共同的病理基礎。這與中醫學對疾病陰陽失調的總體認識極為相似，我們有理由相信，中醫陰陽的分子生物學基礎可能在于DNA高甲基化與低甲基化。因此，從中醫“陰陽自和”的角度出發，調節疾病異常的高甲基化基因與異常的低甲基化基因，使其恢復正常，對于疾病的治療具有重大意義。

3 中醫藥對動脈粥樣硬化DNA甲基化的作用

3.1 中醫學對于動脈粥樣硬化的認識 中醫學雖無“動脈粥樣硬化”的病名，但有關其證候和病因病機在歷代文獻中早有記載，多見于中醫學的“胸痹”“脈痹”“中風”等范疇。“脈痹”始見于《黃帝內經》。《黃帝內經》云：“經脈者，所以能決死生，處百病，調虛實，不可不通。”大多數學者均認為本病為本虛標實之證，本虛病位主要在肝、脾、腎三臟，其虛主要指氣虛、陰虛、陽虛，標實即痰濁、瘀血、熱邪、毒邪等。《金匱要略》記載：“心下有支飲，其人苦冒眩，澤瀉湯主之。”基于痰濁致病的證候特點，由于機體功能失調導致產生致病產物引發疾病的產生，而致病產物又可以反過來作為新的致病因素加速病情的發展與惡化，造成更大的危害。另外有研究[26]證實，痰濁與血脂具有一定的相似性，高脂血癥、動脈硬化指數、痰濁證及血脂指標互相之間存在密切的關聯性。痰濁的致病機理與氧化應激過程類似。《素問·痹論篇》指出：“痹在于脈則血凝而不流”。另外，《醫學綱目》記載：“中風皆因脈道不利，血氣閉塞也。”均表明“血瘀致經脈閉阻”也是動脈粥樣硬化的生物學基礎，引起相關血流動力學障礙是發生AS的直接因素。

隨著眾多中醫學者對本病病因病機更深入的探討，對其也產生了許多新的認識，如認為“伏邪”“脈濁”是AS硬化的另外病因，參與AS的形成和發展[27]。人體內的邪氣未能及時清除，或邪氣潛伏于脈府，日益積聚增多，待時而發，待機而作，即謂之“伏邪”，正虛之時導致脈府損傷。血中之脂質為水谷精微中厚濁且富有營養的部分所化，適當則為身體所之需，過多則為邪為害。濁邪留滯脈道，積聚日久為痰、為瘀、為熱、為毒。現代研究認為AS的病因及發病機制復雜，高血脂是主要因素，通過損傷血管內皮、刺激平滑肌細胞增生、致血管壁細胞凋亡等多種機制相互作用下損傷動脈血管，同時中醫學的“脈”與西醫的循環系統也存在高度相關性。

因此，將“伏邪”“脈濁”與AS聯系起來，使之既與現代醫學的認識互通，又符合傳統中醫理論，使臨床實踐中的辨證與辨病能夠更好地結合起來，從而可以更好地利用中醫方法對AS干預，解決目前臨床問題。

3.2 中藥調控DNA甲基化防治動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化是威脅人類生命及健康的嚴重疾病之一，是許多疾病的“罪魁禍首”，因此開展針對AS防治研究具有重要意義。現代醫學在AS防治方面效果往往不理想，降脂藥物常伴有明顯的毒副作用，甚至導致肝腎功能異常。與西藥比較，中藥具有作用多靶點、毒副作用小等優點。中藥通過調節血脂、抗氧化應激、抗血小板聚集、抗血栓及抗平滑肌細胞增殖等途徑，干預AS發生和發展的各個環節，在AS防治中具有較好的效果。中藥是我國傳統文化發展的重要醫藥歷史寶庫，然而臨床上中藥用于治療AS具體機制還需要進一步探索，這將對促進中醫藥現代化發展有著重要的意義。隨著對中藥有效成分抗AS研究的不斷深入，其機制的研究也日趨廣泛，已從整體組織器官水平，深入到細胞、分子、基因表達與調控水平，當前越來越多的研究表明，中藥通過調控DNA甲基化修飾過程，從而治療疾病[28]。

3.2.1 中藥單體成分調控DNA甲基化對AS的影響DNA甲基化作為表觀遺傳學的關鍵部分，其可通過調節特異性基因的表達，進而干預AS的發生發展。KUMAR U等[29]研究發現，姜黃素通過影響DNA甲基轉移酶3b（DNA methyltrans-ferase 3b，DNMT3b）的轉錄水平，進而調控乳腺癌細胞SK-BR-3的DNA甲基化水平，從而抑制癌細胞生長，這充分表明姜黃素在癌細胞中具有很好的去甲基化作用。姜黃素是從姜科植物的根莖姜黃中提取的一種酚類色素，是一種很好的DNA甲基化抑制劑，其具有多種生物學活性，如抗氧化、抗炎、抗凝、抑制血管平滑肌細胞的增殖、抗動脈粥樣硬化，還具有明顯的抗腫瘤作用。同時，研究[30]發現姜黃素與DNMT1發生共價結合來抑制DNA甲基轉移酶的表達，使18 SRRNA基因啟動子發生甲基化，影響核糖體DNA轉錄，抑制血管平滑肌細胞的增生，起到穩定AS斑塊的作用。另一研究[31]發現中藥成分梔子苷可以調控ox-LDL誘導的泡沫細胞異常基因甲基化，使得泡沫細胞的增殖受到抑制，影響多個與AS相關功能通路，同時起到降脂作用，進而發揮出抗AS作用。總之，中藥單體成分可以通過對DNA甲基化的調控作用影響AS的發展。

3.2.2 中藥復方成分調控DNA甲基化對AS的影響 目前中藥復方是動脈粥樣硬化DNA甲基化的主要研究方向。例如，趙偉峰等[32]發現在通過中藥作用DNA甲基化穩定粥樣斑塊的基礎研究中，血府逐瘀膠囊（主要由桃仁、紅花、赤芍、川芎等組成）、四季三黃膠囊（由大黃、黃芩、黃柏、梔子組成）二者聯合作用可使得體內甘油三酯的含量降低，同時提高AS小鼠模型的整體血清DNA甲基化水平和DNMTS水平，增加斑塊的穩定性。此外，中藥復方對血管平滑肌細胞DNA甲基化也具有調控作用。如程修平等[33]研究發現穩斑湯（主要由全蝎、蜈蚣、地龍、水蛭等組成）聯合西醫常規治療可顯著降低冠心病患者血漿血栓調節蛋白（TM）基因啟動子甲基化水平，促進TM基因表達，增強抗凝作用，保護血管內皮細胞，穩定動脈粥樣硬化斑塊。因此，中藥復方的有效作用可能是通過調控DNA甲基化來抑制動脈粥樣硬化。積極發揮中醫藥的獨特優勢，從分子水平深入研究中醫藥調控DNA甲基化干預動脈粥樣硬化的作用機制，將是可行的。

4 展望與挑戰

隨著表觀遺傳學檢測技術的進步及分子生物學等領域的拓展研究，中藥與DNA甲基化調控機制的具體靶點和相關機制會進一步得以證實。深入探索疾病的DNA甲基化模式，以期發現新的動脈粥樣硬化分子治療靶點及中醫藥作用機制，有望成為未來治療策略發展的基礎。