小檗堿抗腫瘤作用機制研究進展

程靖，周小杰（.黃山市產品質量檢驗研究院 黃山市藥品不良反應監測中心，安徽 黃山 245000；2.浙江中醫藥大學中醫藥科學院，杭州 30053）

腫瘤嚴重危害人類健康，國際癌癥研究機構（IARC）發布的數據顯示，2018年全球新增癌癥病例約有1810萬例，腫瘤導致死亡病例約960萬例，預計到2030年，年新增病例數將達2360萬[1]，因此，尋找預防和治療腫瘤的有效藥物至關重要。小檗堿是一種從黃連、黃柏等中草藥中提取分離的小分子異喹啉生物堿，對消化系統、心血管系統、神經系統等疾病具有廣泛的藥理活性[2]。雖然小檗堿在臨床治療腫瘤鮮有報道，但是大量的體內動物和體外細胞研究證實，小檗堿對胃癌[3]、乳腺癌[4]、膀胱癌[5]、肝癌[6]及其他腫瘤[7]均具有顯著的抗腫瘤作用，是一個潛在的抗腫瘤藥物，但目前對小檗堿抗腫瘤的作用機制研究仍不明確，本文擬從小檗堿對細胞周期和凋亡、細胞自噬的調節、腫瘤細胞的侵襲和轉移的抑制、腫瘤微環境、microRNA表達的調節、端粒酶活性以及腸道菌群的調節等方面，探討小檗堿的抗腫瘤作用機制。

1 小檗堿對細胞周期的調節

正常細胞轉變成腫瘤細胞與細胞周期密切相關[8-9]，細胞周期受細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調節，腫瘤細胞始終處于增殖狀態不能進入靜止期。研究表明小檗堿可調節細胞周期抑制腫瘤細胞增殖，Sakaguchi等[10]在研究中分別用1 μmol·L－1和10 μmol·L－1的小檗堿處理乳腺癌MCF7細胞和非致瘤性上皮MCF12A細胞，發現小檗堿能通過增加p53蛋白表達減少CDK抑制蛋白（CDKI）p21的表達，從而抑制這兩種細胞系的細胞增殖，使其停滯于G0/G1期。用X線與小檗堿聯合處理HepG2細胞，發現小檗堿可增加腫瘤細胞的氧化應激，減少線粒體的ATP水平，顯著抑制細胞增殖，有很好的G2/M阻滯作用[11]。王佳豪等[12]研究認為小檗堿可以顯著抑制腸癌Caco-2細胞增殖，其作用機制可能與阻滯細胞周期于G2/M期從而誘導細胞凋亡有關。在MDA-MB-231乳腺癌細胞中，小檗堿能夠下調修復交叉互補基因1（XRCC1）的表達，使細胞停滯于S期，并誘導DNA斷裂，增加腫瘤細胞對化學療法的敏感性[13]。Xiao等[14]研究表明小檗堿是通過抑制Cyclin D1和Cyclin E1的表達將A549肺癌細胞周期阻滯在G1期，小檗堿還可以抑制Rb蛋白的磷酸化，從而阻止轉錄激活因子E2F從Rb上解離，并抑制了從G1到S期的轉變。上述研究均表明小檗堿可通過調控細胞周期進程來抑制腫瘤細胞的增殖。

2 小檗堿對細胞凋亡的調節

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種調控形式。主要有兩條途徑，第一條為細胞質途徑，由死亡受體Fas（腫瘤壞死因子受體超家族的成員）與Fas配體（FasL）結合啟動凋亡信號的轉導激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8（caspase-8）引起細胞凋亡；第二條是線粒體途徑，線粒體釋放的細胞色素C在dATP存在的條件下與凋亡相關因子1（Apaf-1）結合，激活caspase-9，被激活的caspase-9能激活其他的caspase如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡，線粒體還釋放凋亡誘導因子（AIF），參與激活caspase。在白血病HL-60細胞中，小檗堿可通過增加caspase-8和caspase-9的表達激活caspase-3，從而促進腫瘤細胞凋亡[15]。在皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中，小檗堿可通過增加細胞色素C的釋放激活caspase，從而誘導細胞凋亡[16]。在神經母細胞瘤中，小檗堿通過增加Bax、caspase-3蛋白表達，減少Bcl-2蛋白表達誘導細胞凋亡來抑制腫瘤的生長[17]。小檗堿與大黃素聯合應用可顯著抑制乳腺癌細胞中鹽誘導性激酶3（SIK3）的表達，從而導致乳腺癌細胞生長減少，細胞周期停滯和細胞凋亡增加[18]。

3 小檗堿對細胞自噬的調節

自噬也是細胞程序性死亡的一種方式，是一種重要的胞內物質代謝分解過程，可通過溶酶體吞噬及降解自身結構蛋白及細胞器，使細胞進行再循環，在維持細胞穩態中起著重要作用。在病理條件下，自噬通常被認為具有保護作用，腫瘤生長、發生和抑制過程中起關鍵作用。近年來，小檗堿對自噬的調控已被廣泛研究。Liu等[19]研究表明，小檗堿通過抑制蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素復合物1（Akt/mTORC1）信號轉導途徑誘導EU-6和SKW-3細胞自噬，顯示出治療急性淋巴細胞白血病的潛力。在乳腺癌中，小檗堿通過調節c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化并促進B淋巴細胞瘤-2/beclin-1（bcl-2/beclin-1）復合物的解離而誘導細胞自噬死亡[20]。在對胃癌的治療中，小檗堿可觸發胃癌BGC-823細胞自噬，通過MAPK/mTOR和Akt信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖[21]。但是，另外一些研究表明，小檗堿可抑制細胞自噬，Wang等[22]用小檗堿處理對阿霉素耐藥的MCF-7乳腺癌細胞發現小檗堿通過調節PTEN/Akt/mTOR信號通路來充當潛在的自噬抑制劑，阻止自噬相關蛋白LC3Ⅱ的積累，從而抑制細胞自噬。自噬介導的耐藥性在腫瘤發展中起著重要作用，并且腫瘤細胞通過調節自噬來逃避凋亡，小檗堿可能通過調節miR-30家族來抑制beclin-1表達，顯著降低脂肪細胞自噬。

4 小檗堿對腫瘤細胞侵襲和轉移的抑制

腫瘤的主要特征是腫瘤細胞的侵襲和轉移，腫瘤細胞能夠通過血液或淋巴系統遷移并侵襲人體的不同組織或部分，從而形成新的腫瘤，在惡性腫瘤患者中，腫瘤細胞的侵襲和轉移是導致死亡的主要原因。Zheng等[23]對乳腺癌細胞MDA-MB-231研究中發現，小檗堿在正常情況下不會影響細胞活力，但能夠降低刮擦傷口模型中腫瘤細胞的遷移能力，從而延長傷口愈合時間。Ma等[24]研究表明小檗堿通過在乳腺癌細胞中靶向抑制Ephrin-B2并抑制基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9的表達來抑制細胞增殖和轉移。小檗堿還可通過下調轉化生長因子-β1（TGF-β1）抑制MMP-2和MMP-9的表達[24]，通過上調鈣黏附蛋白E（E-cadherin），下調波形蛋白（Vimentin）及轉錄因子Snail1、Slug的表達，抑制TGF-β1誘導的上皮向間充質轉化，以防止肺癌的侵襲和轉移[25]。血管生成在肺中葉惡性腫瘤的進展和轉移中起著關鍵作用，研究表明[26]，小檗堿能夠抑制腫瘤細胞中血管內皮生長因子（VEGF）mRNA的表達，誘導eEF2磷酸化，導致VEGF表達降低，從而抑制細胞的侵襲和轉移。此外，在SW480大腸癌細胞中，小檗堿通過下調GRP78的表達來抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[27]。在三陰性乳腺癌細胞中，小檗堿通過抑制TGF-β1和下調Smads抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[28]。上述研究均提示小檗堿能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。

5 小檗堿對腫瘤微環境的影響

腫瘤細胞分泌細胞因子改變周圍的腫瘤微環境，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移。在骨肉瘤中，小檗堿下調caspase-1/IL-1β信號傳導途徑改變了炎癥微環境，導致細胞凋亡[29]。小檗堿可以在乳腺癌細胞系MCF-7中上調抗癌細胞因子β-干擾素（IFN-β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[30]。在自身免疫性疾病中，小檗堿通過與T細胞和DC細胞直接相互作用來抑制Th17反應[31]；可通過抑制IL-1β信號傳導和抑制軟骨損傷來改善骨關節炎[32]；通過抑制IL-2、IL-6等促炎性基因的表達來影響巨噬細胞和嗜中性粒細胞的吞噬作用[33]；通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制ROS，從而保護PC-12細胞免受氧化損傷[34]。小檗堿通過阻斷IL-6和TNF-α，抑制炎癥反應驅動的EGFRERK信號傳導，并對結腸炎相關的大腸癌發揮抗腫瘤作用[35]。此外，Du等[36]成功構建了氧化石墨烯負載的新型化療藥物小檗堿衍生物B3的酸性腫瘤微環境條件和近紅外激光雙應答，實現了對腫瘤細胞的靶向協同治療。總之，小檗堿可通過影響炎癥反應和免疫分子等來調節腫瘤的微環境。

6 小檗堿對microRNA的影響

MicroRNA（miRNA）是一類長度在19～23個核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA，通過與3'-非翻譯區的結合，參與RNA沉默和基因表達的轉錄后調控。在細胞增殖、凋亡、分化和器官發生等許多生物過程以及人類疾病（如腫瘤、糖尿病）中，miRNA都已成為重要的調控元件。許多miRNA的異常表達與腫瘤的發生發展密切相關[37]。小檗堿可通過調節miRNA的表達或與其相互作用來抑制腫瘤的侵襲和轉移。Feng等[38]研究發現，小檗堿可能通過TP53、Erb和MAPK信號通路部分抑制3個miRNA簇（miR-99a～miR125b、miR-17～miR92和miR-106～125），從而抑制多發性骨髓瘤，其中，miR-99a～miR125b群集可能是多發性骨髓瘤治療的新靶標。小檗堿還可通過IL6/STAT3下調miR-21的轉錄和表達，誘導多發性骨髓瘤細胞株的凋亡、G2期細胞周期阻滯和集落抑制。在肝癌細胞中，小檗堿通過調節miR-22-3p和SP1及其下游靶標cyclin D1（CCND1）基因和Bcl-2來抑制腫瘤細胞的生長[39]，上調miR-23a的表達介導p21和DNA損傷誘導基因（GADD45α）的轉錄激活[40]。小檗堿可上調miR-101的轉錄，調節子宮內膜癌細胞中COX-2的轉錄，從而抑制子宮內膜細胞的生長、遷移、侵襲和轉移[41]。在結腸癌細胞中，小檗堿可下調miR-429并抑制E-cadherin表達，可能是治療結直腸癌的潛在治療藥物[42]。盡管研究表明小檗堿通過與miRNA相互作用抑制腫瘤的侵襲與轉移，但相互作用位點和作用機制有待進一步探討。

7 小檗堿對端粒酶活性的調節

端粒酶是細胞中基本的核蛋白逆轉錄酶，其活性在正常細胞中受到抑制，而其異常激活會導致腫瘤細胞的增殖不受調控[43]。研究表明，小檗堿和麻風樹堿衍生物可通過靶向調節端粒酶活性，誘導線粒體功能障礙，端粒DNA損傷和細胞周期停滯，誘導膀胱T-24腫瘤細胞凋亡，從而發揮抗膀胱癌的作用[44]。小檗堿可抑制AP-2與人體端粒酶反轉錄酶（hTERT）啟動子的結合，從而導致hTERT表達降低和腫瘤細胞永生化的逆轉[45]。另一項研究表明，小檗堿穩定了內源性端粒G-四鏈體的結構，抑制hTR與該復合物的結合，從而抑制端粒酶的活性[46]。以上研究提示，小檗堿可通過抑制端粒酶活性，影響細胞的凋亡、增殖、細胞周期阻滯等發揮抗腫瘤作用。

8 小檗堿對腸道菌群的調節

腸道菌群作為一個微生態系統，人體腸道內的微生物可參與合成體內必需氨基酸、維生素，調節代謝以及促進礦物質的吸收，可通過作用于靶器官，調節宿主的穩態，但當體內的微生態平衡被打破時，機體維持正常生理功能的能力減弱，會使疾病更容易發生，腫瘤的發生發展與腸道微生物的結構、種類及豐度密切相關。Gao等[47]對131名結直腸癌患者的糞便微生物群特征進行研究，發現腫瘤患者的腸道菌群具有明顯的真菌生物失調和真菌網絡的改變。Wang等[48]研究發現高脂肥胖的Apcmin/＋直腸癌小鼠腸道微生物在個體間差異較大，在野生型小鼠的腸道菌群中主要有厚壁菌、擬桿菌、變形菌和疣微菌，在對Apcmin/＋小鼠高脂飼養后，疣微菌比例明顯增加，小檗堿干預能減輕小鼠的直腸癌進展并且改變了小鼠腸道菌群結構，提示小檗堿可能是通過腸道菌群來減緩直腸癌進程。Yu等[49]的進一步研究表明，腸道定植具核梭桿菌能誘導小鼠直腸癌的發生，經過小檗堿干預后，具核梭桿菌、鏈球菌、腸球菌等致病菌水平明顯下降，小鼠中IL-21/22/31、CD40L的分泌以及信號傳導與轉錄激活因子3磷酸化（p-STAT3）、p-STAT5和細胞外調節蛋白激酶1/2磷酸化（p-ERK1/2）的表達均呈現明顯的逆轉，這表明小檗堿可通過調節腫瘤微環境阻斷腫瘤發生相關通路的激活。

9 總結

綜上所述，小檗堿可通過調節細胞周期抑制腫瘤細胞的分裂生長；抑制細胞增殖并抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移；影響炎癥反應和免疫分子等來調節腫瘤的微環境；調節microRNA的表達或與其相互作用來抑制腫瘤的侵襲和轉移；抑制端粒酶活性，影響細胞的凋亡和周期阻滯等；調節腸道微生物來抑制腫瘤。提示小檗堿可用來開發治療腫瘤，但對小檗堿的應用仍然面臨許多難題，如小檗堿水溶性差、腸道中吸收率低、口服生物利用度低等。因此，對小檗堿開發利用需要進一步的研究，Chang等[50]合成的6個小檗堿衍生物較小檗堿具有更強的抑制腫瘤細胞增殖作用，通過研究表明，在C9和C13具有取代基的新型小檗堿衍生物顯示出明顯增強的抗腫瘤增殖活性。聯合用藥可減輕化療藥物的毒副作用，可通過納米技術構建共傳遞系統將小檗堿與化療藥物同時遞送至腫瘤細胞[51-52]，相信隨著對小檗堿研究的持續深入，有望使其成為一種有效的抗腫瘤藥物。