非洲豬瘟相關(guān)檢測及豬場生物安全防控研究進(jìn)展

孫愛軍，王 芮，朱瀟靜，孟澤錕，劉思源，張 帥，靳家鑫，張改平，莊國慶

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 河南 450002)

生物安全是國家安全的重要組成部分，其含義是生物相關(guān)的各種因素對國家社會、經(jīng)濟(jì)、人體健康和周圍環(huán)境所產(chǎn)生的危害或潛在風(fēng)險。生物病原體引起的傳染病是能夠在動物與動物之間，人與人之間，或者動物與人之間傳播流行的一類疾病。2018年在我國發(fā)生的非洲豬瘟(African swine fever，ASF)疫情，是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種豬的急性、烈性、高度接觸性傳染病。是世界動物衛(wèi)生組織(world organization for animal health，OIE)公布的法定報告動物疫病[1]。也是我國重點防范的一類動物疫病[2]。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科，非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是僅有的蟲媒DNA病毒。ASFV基因組大小為170～190 kb，含有151～167個開放閱讀框(ORF)[3]。胞外病毒顆粒直徑為260～300 nm，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，主要由類核遺傳物質(zhì)、核殼、內(nèi)囊膜、核衣殼及外囊膜構(gòu)成[4]。核衣殼蛋白基因p72相對保守，常被用做ASFV分型的依據(jù)[5]。

ASFV的宿主包括家豬、野豬和軟蜱，所有性別、種類、日齡的家豬均易感[6]。作為貯藏和傳播ASFV的宿主之一，病毒在軟蜱體內(nèi)可存活幾個月或者幾年的時間，因在家豬、野豬與蜱之間交叉感染傳播，極易導(dǎo)致在新的地區(qū)ASF的暴發(fā)[7]。ASFV的傳播途徑廣泛，可以通過人傳、物傳、料傳和介質(zhì)傳播，比如患病家豬污染的飼料、飲水、人員和車輛。另外，在一些病例中，病豬打噴嚏、咳嗽也可能會形成氣溶膠傳播[8]。目前尚無安全有效的ASF疫苗及藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，ASF的防控主要依賴于準(zhǔn)確快速的診斷和嚴(yán)格的生物安全措施。本研究總結(jié)國內(nèi)外常用的ASFV檢測技術(shù)最新研究進(jìn)展，及國外豬場實施的生物安全相關(guān)措施，以期為我國ASF的防控提供參考。

1 ASF相關(guān)診斷方法

根據(jù)家豬感染ASF的臨床表現(xiàn)和病理變化，可以將ASFV分為低、中、高等毒力毒株。超急性型病例常由高毒力毒株引起，主要是高熱(42℃)，嗜睡，突然死亡等臨床表現(xiàn)；急性型病例臨床表現(xiàn)高熱(40～42℃)，嗜睡，肢體末端發(fā)紅發(fā)紫，伴有出血點或出血斑，病理變化表現(xiàn)為脾臟腫大出血，淋巴結(jié)呈大理石樣，其他臟器黏膜、漿膜出血等癥狀，通常由中或高毒力毒株引起；亞急性型病例主要由中等毒力毒株引起，臨床表現(xiàn)與急性型類似，但病程較長，病癥嚴(yán)重程度較低；慢性型病例由低毒力毒株引起，主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)大理石樣病變，脾腫大，流產(chǎn)等[9]。ASF的臨床癥狀與其他豬傳染病(豬瘟)相似，只能先根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理變化做出初步鑒別診斷，再進(jìn)一步進(jìn)行實驗室診斷確定病原體。目前，ASFV檢測方法包括各種分子生物學(xué)方法和血清學(xué)方法，常用的檢測方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫熒光試驗(immunofluorescence assay，F(xiàn)A)、膠體金免疫層析試紙條(colloidal gold immunoassay strip)、紅細(xì)胞吸附試驗(hemoadsorption test，HAD)。其中，PCR擴(kuò)增法和ELISA法操作較為方便快捷，穩(wěn)定性和靈敏度高，是OIE推薦的診斷ASF的方法[7]。

1.1 分子生物學(xué)檢測方法

1.1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) PCR可以對微量病原體DNA進(jìn)行大量擴(kuò)增，并進(jìn)行核酸電泳，或者可視化檢測，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、對樣本量要求低等特點。PCR方法是目前實驗室檢測ASFV的常用方法之一。作為ASFV分型依據(jù)的p72，常被用作PCR檢測ASFV的靶基因。此外還有p54、9GL、K205R等。YUZI等[10]根據(jù)所有ASFV毒株的vp72基因的高度保守區(qū)域設(shè)計了針對ASFV的特異性引物，建立了改進(jìn)的PCR檢測方法，該方法比兩種OIE推薦的常規(guī)PCR檢測方法更具有靈敏性。ARIE等[11]基于p72基因建立了RT-PCR的檢測方法，其引物和探針被OIE作為推薦序列。利用TaqMan探針實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法檢測p72，靈敏性可以達(dá)到10拷貝/μL，是普通PCR的100倍，同時具有特異性強(qiáng)、可重復(fù)性良好的特點。MCKILLEN等[12]在PT-PCR的基礎(chǔ)上針對9GL基因設(shè)計了一種用于ASFV快速、靈敏、特異檢測的5′共軛小溝槽粘合劑(MGB)探針實時PCR檢測方法。其靈敏性和OIE推薦的TaqMan探針RT-PCR相當(dāng)，比傳統(tǒng)PCR高10倍。

微滴數(shù)字PCR是近年來新出現(xiàn)的一代PCR技術(shù)，與傳統(tǒng)的RT-PCR方法相比，無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析結(jié)果更加準(zhǔn)確。鄔旭龍等[13]針對ASFVK205R基因分別用RT-PCR和微滴數(shù)字PCR檢測方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明微滴數(shù)字PCR的最低檢測限度可達(dá)到0.36個拷貝，靈敏度是RT-PCR的10倍，也有較強(qiáng)的特異性，微滴數(shù)字PCR法的陽性樣本檢出率較高。使實際生產(chǎn)中的ASFV檢測成為可能。此外，納米PCR也被用于ASFV的檢測，崔尚金等[14]針對ASFVp54基因建立了高效納米PCR檢測方法，采用納米金屬顆粒作為熱導(dǎo)介子，增加導(dǎo)熱性，提高特異性擴(kuò)增的效率，通過敏感性試驗顯示納米PCR最低檢測量為4.30×101拷貝/μL，是普通PCR檢測的1 000倍。BASTO等[15]建立了ASFV巢式PCR檢測方法，與OIE PCR相比該方法具有更好的靈敏度，可用于檢測蜱類種群中ASFV的感染情況，從而有助于排查潛在威脅，及早防控ASF的發(fā)生。

除了用PCR對ASFV單獨檢測外，肖璐[16]建立了能夠同時檢測ASFV、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬流行性日本乙型腦炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重PCR與毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)(QIAxcel)以及多重PCR與液相芯片分析系統(tǒng)(Bio-Plex)聯(lián)用的兩種檢測方法，其中PCR-QIAxcel對ASFV的最低檢測量為4.51×103拷貝/μL，PCR-Bio-Plex對ASFV的最低檢測量為2.54×103拷貝/μL，PCR-QIAxcel和PCR-Bio-Plex檢測方法更加的準(zhǔn)確、高效，同時靈敏度和特異性更好，高通量檢測為多病毒共感染監(jiān)測和防控提供了一個新的思路。

1.1.2等溫擴(kuò)增法 與常規(guī)PCR相比，等溫擴(kuò)增技術(shù)對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，不需要高溫變性、溫度循環(huán)、電泳和紫外觀察等過程，具有簡捷、快速和方便的優(yōu)點。常用的等溫擴(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(LAMP)、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)(CPA)和重組酶聚合酶等溫擴(kuò)增技術(shù)(RPA)。其中LAMP作為一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其檢測速度、敏感性均優(yōu)于普通PCR技術(shù)，LAMP檢測費用遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，可應(yīng)用于實際生產(chǎn)的快速診斷。基于ASFVp72基因建立了LAMP診斷方法，該方法與OIE參考PCR方法比較具有相同的檢測靈敏度[17]。LAMP技術(shù)結(jié)合eva green染料顯色建立了基于p10基因的可視化ASFV檢測方法[18]。使用CPA技術(shù)結(jié)合生物素和FITC特異性標(biāo)記，建立了基于ASFVp54基因的特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便易行、成本低核酸診斷方法，該方法具有不需要專門的設(shè)備，反應(yīng)時間也大大減少。試驗操作不需要專業(yè)的實驗室人員，具有程序簡單，易于操作的優(yōu)點[19]。另一項研究將ASFVp72基因的重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)與側(cè)流層析試紙條(LFD)相結(jié)合，為ASFV現(xiàn)場檢測提供了快速可視化結(jié)果，試驗結(jié)果與實時PCR陽性檢出率一致，且具有較好的特異性。總之，等溫擴(kuò)增技術(shù)擺脫了對大型和昂貴設(shè)備的依賴，能夠快捷便利的實現(xiàn)目的片段的短時間大量擴(kuò)增，結(jié)合試紙條技術(shù)、數(shù)字顯示技術(shù)能夠使檢測結(jié)果便于直觀顯示。

1.2 血清學(xué)檢測方法

1.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 作為常用的實驗室免疫學(xué)檢測方法，ELISA檢測分為抗原檢測和抗體檢測2種，其中抗體檢測ELISA為OIE國際貿(mào)易指定試驗[20]。ELISA取代最早的ASF血清學(xué)分析方法免疫電滲透試驗(IEOP)成為檢測大量血清樣品的方法，具有更高的靈敏性[21]。WARDLEY等[22]建立第1個用于檢測ASFV的直接ELISA方法，該方法可以檢測50～500 HAD50/mL。TABARES等[23]從病毒顆粒中提取p72蛋白的半純化工藝的發(fā)展最先使用了ELISA方法進(jìn)行抗體篩選，減少了以前開發(fā)的抗原發(fā)現(xiàn)的假陽性反應(yīng)的數(shù)量，提高了ELISA檢測的可靠性。后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)p72、p54、p32、p30等蛋白可以作為血清診斷靶點建立ELISA檢測方法[21]。ELISA抗體檢測方便高效，適用于大批量樣本的檢測，但也有局限性，例如采集患病動物的血液有造成ASFV進(jìn)一步散播的風(fēng)險。為了消除這樣的隱患，采集涎液作為檢測標(biāo)本，可避免因血液處理不當(dāng)造成的污染，并采用免疫過氧化物酶染色技術(shù)(immunoperoxidase technique，IPT)和ELISA，對涎液中ASFV抗體水平進(jìn)行了評估。研究結(jié)果表明從感染早期到試驗結(jié)束，通過ELISA和IPT在所有感染動物的涎液樣品中均可檢測到抗體，證明涎液樣品可以替代血清樣品作為診斷樣品[24]。

1.2.2直接免疫熒光試驗(DFA) 直接免疫熒光法是另外一種常用的血清學(xué)檢測方法，其原理是將能與待檢抗原特異性結(jié)合的抗體用熒光素標(biāo)記，在一定條件下與抗原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后洗掉多余的熒光抗體，室溫干燥后封片處理，在倒置熒光顯微鏡下觀察顯色的有無或強(qiáng)弱，對待檢樣品中抗原做定性和定量分析。DFA檢測方法的對象廣泛，可以利用豬的脾、肺、腎和淋巴結(jié)等組織器官制做組織觸片或者冷凍切片，對ASFV抗原進(jìn)行檢測。該方法較適用于ASF急性病例診斷，但不適合快速、大批量的檢測樣本，是ASFV的輔助檢測方法之一。

1.2.3間接免疫熒光抗體試驗(IFA) 間接免疫熒光抗體技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。首先將對應(yīng)某一抗原的抗體與轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞孵育，然后用與一抗對應(yīng)的帶有熒光標(biāo)記的二抗孵育，在熒光顯微鏡下通過激發(fā)光激發(fā)熒光物質(zhì)，根據(jù)熒光對抗原的有無和位置做出判斷。異硫氰酸熒光素(FITC)是IFA常用熒光素。該方法敏感高，成本低，因此適用性更加廣泛，此法常用于ELISA檢測可疑樣品的復(fù)核。HSCHELEE等[25]建立診斷ASF的免疫熒光方法，該方法可以在感染豬樣品中檢測出ASFV，為診斷慢性、感染性ASF提供了一種靈敏、快速的方法。

1.2.4膠體金免疫層析試紙條(GICA) 膠體金免疫層析試紙條依據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)制備而成，是一種快速檢測抗原或抗體的方法。其制備過程是：首先在還原劑檸檬酸鈉的作用下氯金酸(HAuCl4)的水溶液聚集形成特定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠水溶液，在靜電作用下形成穩(wěn)定膠體狀態(tài)。再將ASFV表達(dá)蛋白與膠體金結(jié)合在一起，若標(biāo)本中有待測特異抗原，就可與免疫金復(fù)合物中的抗體結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)可被固相抗體捕獲，由于蛋白質(zhì)分子的某些基團(tuán)帶正電荷，可與帶相反電荷的膠體金牢固結(jié)合，大量膠體金聚集而達(dá)到顯色效果。因為這種結(jié)合是靜電吸引，所以不破壞蛋白質(zhì)的功能特性。基于ASFV重組蛋白p54膠體金顆粒，以葡萄球菌蛋白A(SPA)作為檢測線、p54蛋白多抗作為質(zhì)控線，成功制備了快速檢測膠體金試紙條，結(jié)果表明膠體金試紙條的檢測結(jié)果有著高度敏感性和特異性。在ASFV感染早期，使用膠體金試紙條進(jìn)行檢測，其靈敏度明顯高于以往常用的間接ELISA檢測方法[26]。除此以外，林彥星等[27]利用量子點免疫層析試紙技術(shù)制備的試紙條特異性良好、敏感性高、操作簡便，適用于ASFV抗體檢測。GAO等[19]建立的交叉引物擴(kuò)增結(jié)合免疫層析條(CPA-strip)，操作簡便、快速診斷，適用于ASFV的現(xiàn)場檢測。

1.2.5其他血清學(xué)檢測方法 ALCARAZ等[28]開發(fā)了一種放射免疫沉淀檢測法(RIPA)，RIPA檢測到的自然感染中最具抗原性的ASFV誘導(dǎo)蛋白是病毒蛋白p243，p172，p73，p25.5，p15，p12，p30和p23.5，RIPA的易用性、特異性和敏感性可與免疫印跡法相媲美。PASTOR等[29]利用ASFV胞質(zhì)可溶性抗原(CS-P)建立一種用于ASFV抗體檢測的簡單斑點免疫結(jié)合測定方法(DIA)，與ELISA和免疫印跡(IB)試驗相比，通過DIA檢測全血或保存不良的血清樣品時未檢測到假陽性反應(yīng)。FERNANDEZ等[30]建立免疫組化法(IHC)檢測急性感染ASFV豬的扁桃體組織病理學(xué)變化，通過檢測發(fā)現(xiàn)感染ASFV豬有出血、單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞增多和淋巴細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。免疫組化法特異性好，但對于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度。SZEREDI等[31]使用IHC檢測組織樣品中ASFV的p72蛋白，結(jié)果表明所有福爾馬林固定和石蠟包埋的組織樣品中均存在ASFV，該試驗中的IHC方法對于診斷急性ASF是十分有效的輔助實驗室檢測方法。KAZAKOVA等[32]利用重組表達(dá)的p30蛋白開發(fā)免疫印跡測試系統(tǒng)(Rec p30-IB)，對感染ASFV豬的血清和組織樣品進(jìn)行評估，該方法的特異性和靈敏度分別為98.75%，100%。

1.3 其他檢測方法

1.3.1紅細(xì)胞吸附試驗(HAD) 作為一個ASFV特有的檢測方法，其原理是在體外培養(yǎng)感染ASFV的巨噬細(xì)胞時，紅細(xì)胞與ASFV感染的巨噬細(xì)胞膜發(fā)生吸附現(xiàn)象，巨噬細(xì)胞外圍形成典型的“玫瑰花環(huán)”現(xiàn)象。但HAD試驗的局限性是紅細(xì)胞發(fā)生吸附反應(yīng)之前出現(xiàn)細(xì)胞病變，需要使用FAT或PCR的方法輔助診斷。有研究報道，一些分離株雖然能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，但是不能產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象[33]，因此HAD可用于發(fā)生疑似疫病豬群的輔助檢測。

1.3.2液態(tài)芯片技術(shù) 液態(tài)芯片技術(shù)Luminex xMAP是一種使用熒光羧化微球的高通量檢測系統(tǒng)，可提供多達(dá)100個檢測通道，通過嵌入2種不同比例的熒光染料微球，待檢樣本與其混合后可使樣本帶上熒光標(biāo)記，最后使用專門的流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。WANG等[34]基于液態(tài)芯片技術(shù)Luminex xMAP建立一種能夠同時檢測藍(lán)舌病毒(BTV)、鹿流行性出血熱病毒(EHDV)、貝氏柯克斯體(CB)、ASFV、西尼羅熱病毒(WNV)、伯氏疏螺旋體病毒(BB)、水泡性口炎病毒(VSV)、裂谷熱病毒(RVFV)、埃博拉病毒(EBOV)、施馬倫貝格病毒(SBV)10種蟲媒病原體的液體微珠陣列，可檢測至少10個拷貝的目的基因，該方法具有高通量、高靈敏性、高特異性和重復(fù)性，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.3.3生物傳感器法 生物傳感器是將生物活性材料(酶、DNA、抗體、抗原等)與理化換能器有機(jī)結(jié)合的一門交叉科學(xué)，可進(jìn)行實時和無標(biāo)簽檢測，具有快速篩查，所需樣本量少，靈敏度高等特性，對生物技術(shù)的發(fā)展必不可少。MASSIMO等[35]建立了檢測豬血中ASFV DNA的表面等離子體共振(SPR)檢測方法，并研制了一種ssDNA/LNA嵌合探針作為ASFVp72基因互補(bǔ)序列的“分子誘餌”的無標(biāo)記可重復(fù)使用的核酸生物傳感器，該方法可快速處理多個樣本(最多40個)，單次檢測時間僅需5 min，最低檢測限為ASFV DNA的178拷貝/μL，定量限為245拷貝/μL。該方法可作為ASF的初步診斷方法，具有相對快速、易用、感應(yīng)面的可重用性和檢測成本低等優(yōu)點。

1.3.4聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)(PCLSR)檢測方法 GRZEGORZ等[36]建立了聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)(PCLSR)檢測方法用于檢測感染豬和野豬中是否含有ASFV，該方法使用了3個特異性引物，其中2個是外螺旋引物，對ASFV具有較強(qiáng)特異性，且與CSFV、PRRSV、PEDV無交叉反應(yīng)，對含p72基因的質(zhì)粒擴(kuò)增的敏感度為7.2×102拷貝/μL。該方法結(jié)合了等溫擴(kuò)增PCR和傳統(tǒng)PCR和PT-PCR的優(yōu)點，檢測成本低、使用便攜，可作為ASF現(xiàn)場診斷方法。

1.3.5基于CRISPR/CAS的檢測方法 CRISPR/CAS系統(tǒng)具有準(zhǔn)確識別特定序列的能力，科研人員根據(jù)這種特性將其應(yīng)用到ASFV的檢測中，HE等[37]將CRISPR/CAS檢測與基于熒光的護(hù)理點(POC)系統(tǒng)相結(jié)合，以實現(xiàn)快速準(zhǔn)確的病毒檢測。在沒有核酸擴(kuò)增的情況下，檢測可在2 h可達(dá)到1 pmol/L，該方法具有恒溫、無擴(kuò)增的特點，不需要昂貴的儀器設(shè)備，不需要復(fù)雜和耗時的樣品制備過程，可直接用豬血漿做檢測樣品。Bai等[38]建立RAA-Cas12a系統(tǒng)檢測方法(Cas12a-based On-site and Rapid Detection System，CORDS)，它結(jié)合了重組酶輔助擴(kuò)增(RAA)和CRISPR/Cas12a用于ASFV的檢測。該方法可在1 h內(nèi)識別出ASFV的DNA靶點，且只需要1個培養(yǎng)箱即可，將CORDS試劑凍干到3個試管中，在4℃可以保存7 d，且靈敏度不變。該方法具有快速、靈敏、易操作，凍干的CORDS可進(jìn)行長期運輸和儲存，因此可作為ASFV現(xiàn)場檢測方法。LU等[39]建立了一種由Cas12a介導(dǎo)的的便攜式試紙檢測方法，用于ASFV的快速檢測，利用納米金顆粒-抗體結(jié)合物設(shè)計試紙條與Cas12a介導(dǎo)的ASFV檢測相結(jié)合，無需儀器即可準(zhǔn)確檢測到豬樣本中是否含有ASFV，靈敏度與qPCR方法相當(dāng)。WANG等[40]利用RPA技術(shù)結(jié)合測流層析，借助Cas9蛋白的功能開發(fā)的ASFV CASLFA診斷方法，與RT-PCR診斷符合率達(dá)到100%，操作快速簡便，無需專業(yè)技術(shù)知識和復(fù)雜的輔助設(shè)備的情況下就能使用。

2 規(guī)模化豬場生物安全防控

ASFV對環(huán)境條件具有很高的抵抗力，在0～4℃條件下儲存，可長時間保持很強(qiáng)的感染力，由于感染豬的分泌物和排泄物中存在ASFV，因此很容易污染環(huán)境，成為可能的病毒傳染源[41]，因此豬場是否消毒徹底是控制病毒潛在傳播的關(guān)鍵因素。有效的預(yù)防性消毒是防止傳染病發(fā)生的重要部分，也是豬場生物安全的重要措施之一。選擇有效的消毒方法，嚴(yán)格對豬場進(jìn)行定期消毒，一方面可以有效阻止病原體通過載體傳入豬場；另一方面對阻止病原在豬舍內(nèi)部群體間擴(kuò)散也至關(guān)重要。具體的措施是設(shè)立專門的消毒站對病死豬進(jìn)行無害化處理，其他輔助設(shè)施如在生產(chǎn)區(qū)入口設(shè)淋浴和紫外消毒室，在生產(chǎn)區(qū)大門口設(shè)置車輛消毒池，在各豬舍門口內(nèi)設(shè)腳踏的消毒盆等。ASFV不耐熱，60℃作用30 min即可滅活，使用一般的消毒劑均有效，例如：1%的甲醛、0.007 5%～0.03%的次氯酸鈉、2%的氫氧化鈉、戊二醛、1%的衛(wèi)可、0.003% QAC、克里奧林和來蘇爾等[42]。以下詳細(xì)介紹針對含病毒的不同物質(zhì)所采取的不同消毒方式。

2.1 對攜帶病原的豬肉產(chǎn)品及豬場飼料和飲用水的消毒ASFV可以在豬肉和豬肉產(chǎn)品中長期存活，在室溫下可在腌肉中存活60 d甚至更長時間，ASFV在干腌處理13 d才可被滅活，但此類產(chǎn)品通常的加工時間最長為60 d[43]，因此應(yīng)嚴(yán)禁外來豬肉產(chǎn)品進(jìn)入豬場。保持豬場飲用水的衛(wèi)生對預(yù)防疾病至關(guān)重要，ASFV污染的復(fù)合飼料在22～25℃條件可存活5 d，而在4～6℃的保存條件下可存活40 d[44]。其中泔水中攜帶大量病原體，因此豬場應(yīng)禁止將泔水與飼料混合飼喂生豬[45]。另外，0.5%次氯酸鈉是推薦使用滅活A(yù)SFV的化合物之一，同時也是OIE和美國國際動物生物制品合作研究所所推薦的消毒劑，具有廣譜的抗菌活性，能有效殺滅各種微生物，包括病毒、細(xì)菌、真菌及其芽孢，可用于豬場飲用水的消毒，也可將0.5%次氯酸鈉進(jìn)行噴灑，對于沖洗后潔凈的食槽、貯水槽、用具等的環(huán)境消毒[42]。需要注意的是，有機(jī)物質(zhì)會抵消次氯酸鈉的活性從而使次氯酸鈉喪失消毒作用[46]。

2.2 對豬舍環(huán)境的消毒豬舍環(huán)境的嚴(yán)格消毒是預(yù)防ASF發(fā)生的主要措施，ASFV可以在被感染豬排泄的尿液、糞便中保存3～5 d，墊料也可作為ASFV傳播的基質(zhì)，可以伴隨人員流動和場內(nèi)車輛等工具間接感染其他豬只[43]。GUINAT等[8]研究發(fā)現(xiàn)ASFV通過氣溶膠傳播也是其潛在的途徑。作為生豬的養(yǎng)殖場所，豬舍是整個養(yǎng)殖的核心，需要定期進(jìn)行全方位無死角的消毒，包括養(yǎng)豬場的戶外環(huán)境和養(yǎng)豬場的舍內(nèi)環(huán)境，例如在豬舍的外部，養(yǎng)豬場的墻壁、道路和圍欄應(yīng)噴灑石灰水，消毒池、腳踏盆應(yīng)定期更換消毒劑；全場主干道用石灰水每天白化1次，豬舍外墻1 m范圍內(nèi)鋪設(shè)生石灰消毒，雨后及時添加；豬舍內(nèi)過道通常用石灰水每2 d白化消毒1次，且每天使用戊二醛消毒液噴灑消毒；豬舍內(nèi)每周進(jìn)行帶豬消毒；豬舍建立污染區(qū)和潔凈區(qū)，包括更衣室和淋浴間，員工必須經(jīng)過淋浴才可以從進(jìn)入潔凈區(qū)，禁止任何設(shè)備、人員和的動物直接從臟區(qū)進(jìn)入凈區(qū)[45]。對于泥漿、廢水、糞便等污染物常用熱處理的方式對病毒滅活，這種方法簡單方便且廉價，處理后的污物可直接排放，而選用消毒劑處理可以為氫氧化鈣(石灰)和氫氧化鈉。需要注意的是，在選用氫氧化鈣時，要考慮溫度的因素，在4℃和22℃分別以1%和0.5%的濃度處理30 min可使ASFV失活。對于無法高溫滅菌的設(shè)備可以進(jìn)行戊二醛低溫消毒，而對于戊二醛的使用和暴露需要監(jiān)測，因為戊二醛是一種致癌物質(zhì)。對于器械和醫(yī)療設(shè)備可用3%～5%來蘇爾進(jìn)行消毒，地板墻壁可用5%～10%來蘇爾進(jìn)行消毒，對于非關(guān)鍵的地面和墻壁可用QAC進(jìn)行消毒[46]。

2.3 對豬場人員和車輛的消毒ASFV在環(huán)境中較強(qiáng)存活能力，尤其是受到有機(jī)物的保護(hù)的情況下可以存活時間很長，病毒的抵抗力意味著可能通過被污染的衣服，鞋子，設(shè)備和車輛進(jìn)行傳播[47]。人員流動在傳播病原體中的作用已得到充分的證明，外來人員的衣帽，鞋靴，頭發(fā)等都可能攜帶有病毒[43]，因此，員工進(jìn)豬場前，需在指定隔離點隔離，更換隔離點衣服和鞋靴，自己的衣服鞋子要用消毒液浸泡消毒，設(shè)置專用洗澡消毒通道，在隔離點需要采樣(手掌、鼻孔、頭發(fā)、鞋底)進(jìn)行ASF檢測，檢測結(jié)果為陰性方可進(jìn)場，入場前更換專業(yè)消毒服進(jìn)入。ASFV可以維持很長時間在被污染的產(chǎn)品或車輛上，通過轉(zhuǎn)豬車輛可將病毒帶入豬場[48]，運輸車輛中殘留有糞尿、血漬、體表滲出物、飼料殘渣等，因為ASFV可以承受相當(dāng)大的pH值變化，消毒劑直接作用于這些富含蛋白質(zhì)的污染物是無效的[42]，運輸生豬、飼料或者收集死豬的車輛及駕駛員構(gòu)成了疾病傳播的主要風(fēng)險，在每次運輸后，應(yīng)及時清潔和消毒車輛，必要時使用官方授權(quán)的消毒劑進(jìn)行清潔和消毒，并提供操作執(zhí)行證明，特別注意對車輛與豬接觸的地方，駕駛室以及裝卸時使用的防護(hù)服重點消毒，駕駛員處理動物應(yīng)嚴(yán)格遵守農(nóng)場的生物安全流程，豬場應(yīng)建立生豬裝載區(qū)和禁止駕駛員進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)來預(yù)防車輛污染[6]。對于大面積的車輛等運輸工具，較為有效的消毒措施為2%的燒堿溶液進(jìn)行清洗，污染嚴(yán)重的衣物鞋子在進(jìn)行物理清洗后也需要用2%的燒堿進(jìn)行浸泡清洗消毒[46]。

2.4 對豬場動物媒介管理ASFV除了通過直接接觸患病動物的體液或排泄物，間接接觸受污染的車輛人員感染外，還可以通過蟲媒傳播，ASFV可以在軟蜱中存活至少8周[41]。試驗表明喂食感染ASFV血液的蒼蠅，體內(nèi)病毒存活時間長達(dá)12 h[49]。另一個試驗中，豬食入添加了ASFV血液為食的蒼蠅而感染，證明蒼蠅可作為ASF的潛在傳播媒介[50]，其他吸血的無脊椎動物，如虱子、螨蟲吸食感染ASFV豬的血液后，可傳播病毒[46]。因此，豬場對于ASFV傳播媒介的管理也不容忽視，定期對豬舍進(jìn)行滅蠅，滅蚊和殺蟲，以減少媒介數(shù)量，最大限度減少節(jié)肢動物在ASF中的傳播作用，提高豬場生物安全防控。

3 討論

2018年，我國首次暴發(fā)ASF[51]，并迅速蔓延至全國，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管國內(nèi)外對于ASFV疫苗的研發(fā)已經(jīng)有100多年的時間，迄今為止，尚無安全有效的商業(yè)化疫苗上市。只有采取快速準(zhǔn)確的診斷才能實現(xiàn)對ASF發(fā)生和流行的監(jiān)控。目前應(yīng)用的各種ASFV檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點。ELISA技術(shù)檢測所需樣品的處理時間短，操作程序較為簡單，經(jīng)濟(jì)成本也較低，但是相較于RT-PCR技術(shù)靈敏度較低。RT-PCR技術(shù)具有靈敏度高的特點，但樣品的處理相對繁瑣，且需要較為昂貴的儀器。在PCR的基礎(chǔ)上，LAMP和RPA等溫擴(kuò)增檢測技術(shù)，具有快速簡便、儀器簡單且便于攜帶等特點，適用于生產(chǎn)應(yīng)用，但仍需提高特異性和靈敏度。隨著分子生物學(xué)和血清學(xué)技術(shù)水平的不斷提高，試紙條檢測技術(shù)的靈敏度和特異性方面有很大的提高，同時還具有操作方法簡便、操作時間短、經(jīng)濟(jì)成本低等特點，非常適合基層生產(chǎn)的推廣使用。在這幾種技術(shù)的基礎(chǔ)上，衍生出許多具有更高創(chuàng)新性的檢測方法，但它們的實用效果還需要作進(jìn)一步檢驗。在實際生產(chǎn)的檢測診斷過程中，應(yīng)當(dāng)選擇符合當(dāng)?shù)貙嶋H情況的一種，或者聯(lián)合應(yīng)用多種檢測方法進(jìn)行檢測和確診。

我國是世界上最大的生豬養(yǎng)殖和消費國家。但在生豬的生產(chǎn)過程中缺乏統(tǒng)一的生物安全標(biāo)準(zhǔn)，在運輸、屠宰、肉制品加工等各個環(huán)節(jié)也沒有統(tǒng)一的規(guī)范和管理。另一方面，由于飼養(yǎng)模式、規(guī)模大小、豬場管理和經(jīng)濟(jì)狀況不同等因素的影響，豬場的生物安全措施的制定和執(zhí)行等方面存在眾多問題。目前，只有將生物安全的國家宏觀調(diào)控和生物安全措施的有效實施有機(jī)結(jié)合在一起，才能最大程度地避免ASF疫情的發(fā)生和流行。在健康一體化(one public，one health)的時代背景下，加強(qiáng)動物的生物安全保障，就是對人類健康的有力保障。