生物力學作用對骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化影響研究進展

曹盛楠，師彬，孫國棟，王從安，王丹丹*

(1.山東中醫藥大學 針炙推拿學院，山東 濟南 250353；2.山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)a.山東第一醫科大學附屬頸肩腰腿痛醫院；b.山東省醫藥生物技術研究中心 山東省骨生物力學工程實驗室，山東 濟南 250012；3.山東第一醫科大學第三附屬醫院，山東 濟南 250062；4. 天津大學 醫學工程與轉化醫學研究院，天津 300072)

骨髓間充質干細胞(boneless marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一類具有自我增殖、多向分化潛能的干細胞，具備免疫源性低、方便取材、來源廣泛等優點，常用于細胞組織移植、心血管疾病、骨缺損修復等多個領域[1-2]。研究認為BMSCs在生長過程中可感知不同的生物力學信號，從而影響細胞增殖、成骨分化等功能，而體內BMSCs的生長、成骨分化與骨組織的再生等也離不開復雜的力學作用環境[3-4]。目前已有相關力學對BMSCs影響的研究[5-6]，但采用的力學加載模式、時間、頻率等皆不盡相同，且不同的作用力對BMSCs增殖、分化的影響不同。本文闡述了不同生物力學(牽張力、壓力、流體剪切力)對BMSCs增殖與成骨分化的影響，及其可能作用的基因和信號傳導通路等，為BMSCs的骨組織工程與再生醫學研究及更好地應用于臨床治療提供參考。

1 不同牽張力作用對BMSC增殖和成骨分化的影響

牽張力(mechanical tension stress，MTS)作為一個重要機械調節因素，對BMSCs起到拉伸應力作用[7]。目前國內外已有多種不同力學加載設備及力學刺激方式，其中研究較多的為牽張力。研究證實牽張力可有效促進細胞活性和功能，在骨再生和骨生物工程的臨床應用中有重要指導意義[8]。但不同牽張力對BMSCs的增殖及成骨分化有不同的影響。

細胞的受力大小是無法測量出來的，只能間接通過硅膠膜的形變率、支撐物的上下運動位移來估計(根據牽拉頭尺寸參數表計算, 文中力的強度用百分數來表示)。黎潤光等[9]參考Schaffer建模方法自行建立體外細胞周期性機械牽張力學裝置，在1.0 Hz的頻率下，分別采用不同應力大小、不同時間的機械信號刺激，結果表明12%應力作用下增殖指數最高，可達到無應力狀態下的1.86倍，而采用過強的牽張應力(18%)時，對細胞不具有促進增殖效應；同時，牽張力干預早期可以促進BMSCs增殖，干預時間超過48 h反而表現為抑制生長狀態。井燕等[10]采用雙軸力學應變系統選取0.4%、1.0 Hz頻率、每天3次、每次2 h、間隔2 h的力學應變加載BMSCs，力學應變作用后細胞增殖指數(proliferation index, PI)比相應靜態組增高，動物骨橋蛋白 ( Osteopontin, OPN) 和堿性磷酸酶 ( Alkaline phosphatase, ALP)的表達均有明顯升高，表明力學應變可以提高BMSCs的增殖和成骨分化能力。戚孟春等[11]采用四點彎曲加力系統施加的40 min、0.2%機械牽張力作用于大鼠BMSCs，發現受力組在受力后細胞數明顯高于對照組，BMSCs增殖活力顯著增高并短暫性成骨向分化。通過加載機械張力，模擬骨組織受力情況發現，不同大小、時間、頻率的機械張力均影響BMSCs增殖，大小適宜的機械張力可起到促進作用。

高鶯等[12]同樣采用四點彎曲加力系統對SD大鼠BMSCs施加0.2%機械牽張力，結果顯示其細胞生長曲線與對照組相比差別不大，但骨鈣素表達水平和ALP活性顯著增高，且芯片雜交檢測的差異表達基因數量變化明顯。薛令法等[13]采用Flexcell體外細胞力學加載裝置，施加0.5 Hz頻率、0.8% 形變率、每天2次、每次30 min的間歇性牽張力，可促進小鼠BMSCs成骨分化。Wu等[14]通過Flexercell-5000給予人BMSCs機械拉伸(10%，0.5 Hz)，數據顯示LncRNA H19通過上調下游FAK來介導牽張力誘導的BMSCs成骨分化。Jang等[15]采用單軸拉伸應力單元系統，分別以3%和10% 拉伸力、0.26 Hz頻率給予兔源BMSCs循環張力，結果發現張力促進BMSCs增殖增加，并且10%牽張力趨向平滑肌細胞分化，3%牽張力趨向成骨細胞分化。Song等[16]采用自行組裝的機械拉伸裝置以1 Hz頻率、2%～8%拉伸15～60 min，經MTT檢測后顯示牽張力具有促進BMSCs增殖的重要作用，且采用8%應變、60 min拉伸處理的BMSCs細胞c-fos基因表達明顯升高。通過以上研究發現，一定條件的周期性力學信號刺激可以促進BMSCs向成骨方向分化，但當拉伸幅度及作用時間不同時，可出現不同的細胞分化方向。

2 不同壓力作用對BMSCs增殖和成骨分化的影響

力學刺激對細胞功能及組織發育、重建等有重要影響作用，BMSCs受到多種應力作用，而壓應力同樣作為正常人體關節運動中的主要受力因素，亦可引起細胞生物力學特性的變化[17]，在研究中對BMSCs施以壓應力(hydrostatic stress，HDS)能很好地模擬細胞的體內環境，同時又易于標準化和結果間的相互比較與分析[18]。

劉巖正等[19]采用自行設計的可控細胞液壓加載裝置給予BMSCs細胞相應的靜壓力刺激，結果表明采用90 kPa 靜壓力每天1 h 連續作用2 d促BMSCs增殖與成軟骨向分化的作用最顯著，PCNA、SOX-9、Aggrecan mRNA 的表達均顯著升高。何川等[20]采用自制加壓裝置給予BMSCs加載靜水壓，發現40 kPa的靜水壓連續作用4 d可以促進Cbfa1、OC mRNA表達，連續作用7 d時仍對BMSCs表現為促成骨分化作用，在連續作用14 d時，作用轉變為促成脂分化。李正章等[21]采用自行改制的細胞壓力加載裝置進行力學干預BMSCs，結果顯示分別在5.32、10.64、21.28 kPa壓力干預下細胞增殖指數均明顯升高，MMP-2活性最低；而在29.26 kPa壓力下增殖指數則明顯下降且死亡增多，基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)活性增高。潘景光等[22]采用自行設計制作的細胞液壓加載裝置對BMSCs經動態壓力處理后，在0～45 kPa和0～90 kPa動態正壓作用下，BMSCs增殖活性顯著增強，且與壓力值呈正相關。但通過透射電鏡觀察細胞的超微結構發現0～45 kPa動態壓力作用下可促進細胞蛋白合成，而在0～90 kPa動態壓力作用下，細胞中出現了凋亡小體，證實在該壓力作用下可誘導細胞凋亡。趙永亮等[23]采用 Flexcell-5000基底壓縮加載系統對BMSCs延遲性周期性壓縮應力刺激(正弦波、0.5 Hz、20 kPa、2 h/d 壓縮應力)，結果顯示應力可促進Col2的表達，抑制ROCK通路，并可能通過ROCK通路調控BMSCs成軟骨分化。易飛舟等[24]采用自主研發的細胞液壓加載裝置，分別對BMSCs加載持續靜壓力45、90 kPa及周期性動壓力0～45 kPa、0～90 kPa。數據顯示90 kPa 靜壓作用下Sox9及Aggrecan基因的表達量顯著高于0～90 kPa，而0～45 kPa壓力促Sox9及Col2基因上調的作用則高于45 kPa壓力，且在持續90 kPa的壓力作用下BMCSs成軟骨分化效果顯著。當對BMSCs加載壓力較小時，壓應力可促進BMSCs增殖且向成骨方向分化，而當壓力增大時BMSCs趨向成軟骨方向分化。

3 不同的剪切力作用對BMSCs增殖和成骨分化的影響

骨骼組織中的細胞在生理狀態下，需要一定強度的流體剪切應力(fluid shear stress, FSS)的刺激，使其保持正常的生理功能，同時，培養液的流動也可對所培養的細胞產生流體剪切應力[25]，有研究表明，一定范圍的流體剪切應力可以刺激BMSCs細胞的分化及增殖，保持細胞正常的生理功能[26-27]。

李洪鵬等[28]采用自制平行平板流動腔對BMSCs加載0.3 Pa的流體剪切力刺激30 min，結果表明流體剪切力可提高BMSCs細胞早期的細胞內ALP含量，細胞開始向成骨細胞分化，但未能促使晚期的骨鈣素表達升高，說明此強度的流體剪切力不能成功促進人BMSCs最終實現向成骨方向分化。李立等[29]將BMSCs置于平行板流動腔內，以0.8 Pa切應力條件下誘導24 h，發現BMSCs可轉化成內皮細胞。Kreke等[30]以0.16 Pa的流體剪切力作用于大鼠BMSCs細胞，在成骨誘導培養液(地塞米松、β-甘油磷酸和抗壞血酸)中培養，在第6、8、10和12 d檢測時，流體剪切力促進了骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，BSP)和骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)的表達，促進了OPN蛋白的積累，抑制了脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)的表達；在第20 d檢測30 min的加載力下，OPN及BSP mRNA的表達水平達到最高，同時，持續120 min時成脂標志物脂蛋白脂肪酶的表達最少。劉立躍等[31]發現以0.42 Pa間歇性FSS 培養的BMSCs則向成骨細胞分化明顯，而0.42 Pa持續性FSS和0.034 Pa的FSS對BMSCs沒有明顯的誘導分化作用。Stavenschi等[32]將BMSCs在封閉環境中分別給予不同剪切力，發現剪切力可以促進成骨標志物Cox2、Runx2 和OPN的mRNA表達上調，確定在BMSCs施加2 Hz、2 Pa、FSS時成骨標志物表達上調最明顯。Huang等[33]發現適當的FSS單獨處理可以使心肌細胞相關標記物的表達顯著增加，誘導BMSCs向心肌細胞轉化。由此可見，BMSCs的增殖和分化與流體剪切力的刺激有密不可分的聯系，較低強度的流體剪切力對BMSCs的影響并不大，較高強度的流體剪切力會抑制細胞的成骨分化。

不同生物力學作用大小、頻率、作用時間等對BMSCs增殖和成骨分化的影響，以及相關的作用基因，如表1所示。牽張力一般在24 h內，拉伸幅度為12%以下時，主要通過影響ALP、OPN、COLI、Ets1、Cbfa1、osterix、Runx2等基因，促進BMSCs增殖和成骨分化；壓力范圍在0～90 kPa，每日加壓時間在1～6 h時，主要通過影響Cbfa1、OC促進BMSCs成骨分化；施加剪切力在0.3～2.0 Pa，加載范圍在0.5～2.0 h時，主要通過ALP、OC、Runx2、OCN、COLIα等基因，促進BMSCs成骨分化。

表1 不同生物力學作用大小、頻率、作用時間等對BMSCs增殖和分化的影響

4 生物力學作用影響BMSCs增殖和成骨分化參與調節的信號傳導通路

細胞感受力學信號,通過信號傳導通路，影響基因的表達和蛋白質的合成[34]，機械刺激通過影響整合素表達，繼而整合素將機械刺激轉換為生物力學信號，實現對BMSCs的成骨分化調控。不同力學刺激BMSCs后，BMSCs的整合素α2β1、α5β1、αVβ3等表達量升高，同時以整合素為基礎的FAK參與啟動多條信號通路，通過調控不同的信號通路，進而促進與成骨分化相關基因表達。由此，多種細胞成分在信號傳導中起到重要的作用，如細胞骨架、整合素、離子通道等方面參與機械力學信號轉導[35]。

Simmons等[36]對人BMSCs施加0.25 Hz、3%形變率的牽張力，激活了細胞外信號調節激酶(ERK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，同時發現p38信號通路在BMSCs應變誘導成骨分化的調控中起抑制作用。劉小雅等[37]采用Flexcell細胞力學加載裝置對小鼠BMSCs施加0.5 Hz、0.8%振幅的機械牽張力，結果表明在持續牽張力作用下可通過p38MAPK通路向成骨細胞分化。由此可見，小幅度的牽張力能通過p38MAPK信號通路促進BMSCs成骨分化。趙闖等[38]通過自行研制的細胞加載裝置對BMSCs施加機械張應力0.25%、加力60 min，提示牽張力加載激活了Wnt信號3個關鍵分子Wnt3A、β-catenin與Lef-1，并刺激BMSCs增殖與骨向分化過程。另有研究者用Flexcell應變裝置對大鼠BMSCs給予機械張應力10%、0.5 Hz頻率，每日2次循環拉伸刺激，通過短干擾RNA下調Cbfa1基因表達后，成骨標記物表達出現下降，證明了牽張力刺激可能通過ERK1/2激活的Cbfa1信號通路促進大鼠BMSCs成骨分化[39]。同時，研究表明整合素-FAK信號通路參與了機械牽張誘導BMSCs成骨分化的調節，整合素介導的FAK活化后，Ras-Raf-MAPK/ERK、FAK-PI3K-Akt等信號通路可能進一步激活，調控細胞功能[40]。

杜靜等[41]采用自主研發的靜態液壓加載裝置對兔BMSCs加載120 kPa、每天1 h、連續4 d的力學刺激，結果顯示壓力刺激后，BMP2及Smad1/Smad5表達明顯上調，同時促進 BMSCs軟骨方向的分化。陳驥等[42]采用自行設計制作的可控細胞液壓加載裝置給予90 kPa壓強加載1 h，提示壓力可以通過激活RhoA的活性可促進DNA合成及細胞增殖，并在成骨誘導早期，依賴RhoA活性，壓力可促進BMSCs成骨分化，而在成骨誘導晚期，RhoA活性抑制，OPN下調，壓力對成骨分化晚期起抑制作用。另有研究者采用可控細胞液壓加載裝置對大鼠BMSCs施加90 kPa流體靜壓力，結果顯示BMSCs中Sox9、Aggrecan及ColII的mRNA表達量增加，且Rac1在流體靜壓力導致的細胞成軟骨分化過程中亦具有調控作用[43]。此外，靜水壓力還可通過Wnt-RhoA-ROCK調節BMSCs，進而影響早期成骨分化標志物基因的表達[44]。

研究者使用平行板培養箱研究剪切應力對人BMSCs成骨分化的調節能力，結果顯示在1.2 Pa的流體剪切應力作用下，在一段時間內對Cbfa1/Runx2基因的表達有影響，而BMSCs的成骨活性迅速增強，I型膠原基因的表達下降，這些效應依賴于p38和ERK1/2的激活[45]。同時，Liu等[46]證實通過信號通路，間歇性流體剪切力可以誘導人BMSCs成骨分化。首先β1整合素感知細胞外間歇性FSS的刺激后，通過激活FAK活化ERK1/2導致Runx2磷酸化，磷酸化的Runx2啟動成骨基因的轉錄，進而促進BMSCs向成骨細胞分化；其次，間歇性FSS激活的ERK1/2通過激活NF-κB增加BMPs的表達，BMPs的增加導致BMP/Smad通路的激活，最終導致Runx2的表達；再次，間歇性FSS激活的ERK1/2通過介導NF-κB的活化影響β1整合素的表達。

由此可見，不同生物力學作用影響BMSCs成骨分化的相關信號傳導通路，如圖1所示。牽張力作用下主要通過整合素表達，啟動FAK-PI3K-Akt、Ras-Raf-MAPK/ERK等信號通路，壓力作用BMSCs后激活Wnt-RhoA-ROCK等信號傳導通路，流體剪切力作用后激活BMPs/Smad、FAK-ERK-NF-κB等信號通路，調節下游Runx2、ALP、OCN、OPN、COL等相關基因的作用，影響BMSCs的增殖和成骨分化。

5 研究展望

BMSCs是一類來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的干細胞[47]。由于其易于分離培養、體外增殖能力強、成骨分化特性較好，可作為骨組織工程的理想種子細胞[48]，近幾年研究者運用物理機械力學加載BMSCs，通過模擬細胞在體內微環境狀態，研究其調節作用[49]，結果表明各種物理性刺激均可影響BMSCs的生物學特性[50]。雖然實驗方法與參數等設計各有不同，但仍可以得出一些共性點：適當的牽張力及流體剪切力對細胞產生的刺激不僅具有增殖效應，且大部分可使其向成骨方向分化；靜壓力加載于BMSCs時，細胞增殖活性也顯著增強，對細胞產生的刺激大部分會使其向成軟骨方向、成脂方向分化；在生物力學加載過程中，PI3K、AKT、Wnt、BMP/Smad、RhoA、ERK等信號傳導通路對BMSCs的增殖、分化起著重要作用；但超過適當的強度刺激范圍時，對BMSCs自身的分化會產生抑制作用。目前國內外學者不斷模擬細胞所在力學微環境，促進了人們對力學微環境與BMSCs之間聯系的了解，但也不能僅僅使用獨立的因素研究機械因素和細胞之間的關系[51]。

此外，也仍有很多問題需進一步探索。例如如何進一步了解細胞感受機械信號傳導的機制；BMSCs在發育、疾病、創傷修復中如何感知復雜機械環境刺激等。隨著對BMSCs感受生物力學研究的深入，相信可以為BMSCs的組織工程與再生醫學研究更好地應用于臨床治療等提供參考，為治療應力性骨折和骨質疏松等疾病奠定理論基礎。