新型冠狀病毒預(yù)防Ⅱ號方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

郭 舟，王 康，張 勤△，閆俊鋒，唐 松

（1.湖北省襄陽市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 襄陽441004；2.湖北省藥品監(jiān)督管理局襄陽分局，湖北 襄陽441022）

新型冠狀病毒（簡稱新冠病毒）預(yù)防Ⅱ號方為由湖北省襄陽市疫情防控指揮部批準(zhǔn)同意，指定醫(yī)院配制并調(diào)劑使用的中藥制劑，用于預(yù)防新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)，效果良好，具有益氣固表、祛濁排毒功效。方中，黃芪性甘微溫，內(nèi)可補(bǔ)益肺脾，外可固表止汗，為君藥［1］；炒白術(shù)、連翹、金銀花補(bǔ)氣健脾、清熱解毒、消炎排毒，有助于加強(qiáng)黃芪益氣固表功效，為臣藥；其他藥味具有佐藥或使藥功效。但該方劑為特殊時期臨時調(diào)劑使用，無國家的制劑批準(zhǔn)文號，其質(zhì)量無法進(jìn)行評價。黃芪在各類新冠肺炎預(yù)防方劑中出現(xiàn)的頻次最高，故測定黃芪的含量十分必要［2-5］，而黃芪甲苷是黃芪的活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎和抗病毒等作用［6-8］。連翹苷是連翹中含量較高的主要活性成分，具有極強(qiáng)的抗菌、抗病毒和抗炎作用［9-10］。本研究中采用薄層色譜法對主要藥味黃芪、連翹進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對其主要活性成分黃芪甲苷、連翹苷進(jìn)行含量測定?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀［配有2424型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD)，美國Waters公司］；島津LC-20AT型高效液相色譜儀［配有二極管陣列檢測器（DAD），日本島津公司］；XS205型電子天平（精度為0.01 mg），AL204型電子天平（精度為0.1 mg），均購自瑞士梅特勒-托利多公司；HU-6150B型超聲波清洗器（天津恒高電氣科技有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；G201990806型硅膠G板（青島海洋化工有限公司）；ZF-I型三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；202-1AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，Sigma-Aldrich公司），超純水，其余試劑均為分析純；黃芪甲苷對照品（批號為110781-201717，含 量 為96.9%），連 翹 苷 對 照 品（批 號 為110821-201816，含量為95.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；新冠病毒預(yù)防Ⅱ號方（由指定的醫(yī)院制作，批號分別為20200229，20200324，20200527，規(guī)格為每瓶200 mL）；黃芪陰性樣品（按處方比例取除黃芪外的藥材，按指定醫(yī)院工藝制備）；連翹陰性樣品（按處方比例取除連翹外的藥材，按指定醫(yī)院工藝制備）。黃芪(批號為200101)，炒白術(shù)(批號為200101)，均購自湖北同仁恒康中藥飲片公司；防風(fēng)(批號為20191201)，連翹(批號為20200101)，金銀花(批號為20200102)，佩蘭(批號為20200202)，焦山楂(批號為20190901)，均購自武漢市漢口國藥公司；陳皮(批號為20200101，襄陽華源天盛藥業(yè)公司)；紫蘇(批號為20200021，國藥控股襄陽公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

黃芪：取3批樣品，各30 mL，用30 mL水飽和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，用40 mL氨試液洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，加1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。取黃芪陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備黃芪陰性對照品溶液。另取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。吸取供試品溶液、黃芪陰性對照品溶液、對照品溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）下層液為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇液，105℃烘箱加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的棕褐色斑點(diǎn)，黃芪陰性對照品溶液色譜無此斑點(diǎn)；置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品溶液和對照品溶液顯相同顏色的橙黃色熒光斑點(diǎn)，而黃芪陰性對照品溶液色譜無此斑點(diǎn)。詳見圖1。

圖1 黃芪薄層色譜圖1-3.test solution 4.reference solution 5.negative reference solution A.Sunlight B.Ultraviolet lampFig.1 TLC chromatograms of Astragail Radix

連翹：取3批樣品，各30 mL，用30 mL水飽和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，用40 mL氨試液洗滌3次，棄去水液，再用正丁醇飽和的水洗至近中性，正丁醇液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取連翹陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得連翹陰性對照品溶液。另取連翹苷對照品適量，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度為60μg/mL的對照品溶液。吸取供試品溶液、連翹陰性對照品溶液、對照品溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以氯仿-甲醇（5∶1，V/V）為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇液，105℃烘箱加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而連翹陰性對照品溶液色譜無此斑點(diǎn)；置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品溶液與對照品溶液顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而連翹陰性對照品溶液色譜無此斑點(diǎn)。詳見圖2。

圖2連翹薄層色譜圖1-3.test solution 4.reference solution 5.negative reference solution A.Sunlight B.Ultraviolet lampFig.2 TLC chromatograms of Forsythiae Fructus

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜條件

圖3 黃芪甲苷含量測定高效液相色譜圖1.astragalosideⅣA.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solution Fig.3 HPLC chromatograms for content determination of astragalosideⅣ

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（32∶68，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5～20μL。ELSD參數(shù)：噴霧器為冷卻模式，漂移管溫度為60℃，氣體壓力為30 Psi。

2.2.2 溶液制備

取黃芪甲苷10.78 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.208 9 mg/mL的對照品溶液。精密量取供試品25 mL，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，再用氨試液洗滌3次，每次40 mL，棄去水層，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容? mL，搖勻，取上清液，即得供試品溶液。按供試品溶液制備方法制備黃芪陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下3種溶液，依法測定。結(jié)果對照品溶液和供試品溶液在16～17 min處有相同色譜峰，黃芪陰性對照品溶液則無此色譜峰。詳見圖3。

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液（質(zhì)量濃度為10.208 9 mg/mL）5，10，20，30，40μL，依法測定，以峰面積的對數(shù)（lgA）為縱坐標(biāo)、黃芪甲苷進(jìn)樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)（lgC，μg）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程lgA=1.561 38 lgC+4.647 017，r=0.999 6（n=5）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在1.044 5～8.356 7μg范圍內(nèi)對數(shù)值與其峰面積對數(shù)值線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：以信噪比(S/N)=3∶1為標(biāo)準(zhǔn)測得黃芪甲苷的最低檢測限為0.2434μg，以S/N=10∶1為標(biāo)準(zhǔn)測得黃芪甲苷的定量限為0.811 3μg。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.208 9 mg/mL）20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測定。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD為0.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批(批號為20200324)樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果樣品中黃芪甲苷的平均含量為0.037 2 mg/mL，RSD為1.01%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為20200324）樣品，分別于0，3，6，9，12，24 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果黃芪甲苷峰面積含量的RSD為1.33%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取同一批（批號為20200324，含量為0.037 2 mg/mL）樣品6份，各20 mL，分別精密加入對照品溶液1.00，1.00，2.00，2.00，3.00，3.00 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，依法測定含量，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Recovery test of astragalosideⅣ（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

精密量取3批（批號分別為20200229，20200324，20200527）樣品各25 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對照品溶液分別進(jìn)樣5μL和20μL，供試品溶液進(jìn)樣10μL，依法測定峰面積，按外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計算含量。結(jié)果樣品中黃芪甲苷的含量分別為0.032，0.037，0.040 mg/mL。

2.3 連翹苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（20∶80，V/V）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：277nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.3.2 溶液制備

圖4 連翹苷含量測定高效液相色譜圖1.phillyrinA.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms for content determination of phillyrin

取連翹苷15.85 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得連翹苷質(zhì)量濃度為60.29μg/mL的對照品溶液。精密量取本品10 mL，加甲醇適量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，冷卻后定容至25 mL，搖勻，濾過，即得供試品溶液。按供試品溶液制備方法制備連翹陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.3.2項(xiàng)下3種溶液，依法測定。結(jié)果連翹苷對照品和供試品溶液在30～31 min處有相同色譜峰，連翹陰性對照品溶液無此色譜峰。詳見圖4。

線性關(guān)系考察：精密量取對照品溶液（質(zhì)量濃度為60.29μg/mL），加甲醇制成系列質(zhì)量濃度為6.029 3，12.058 7，30.146 7，60.293 4，90.440 1，120.586 8μg/mL的溶液，依法測定峰面積。以連翹苷質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得 回 歸 方 程Y=6 535.279 27X-3 455.049 39，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明，連翹苷質(zhì)量濃度在6.029 3～120.586 8μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限、定量限考察：以S/N=3∶1為標(biāo)準(zhǔn)測得連翹苷的最低檢測限為0.016 4μg，以S/N=10∶1為標(biāo)準(zhǔn)測得黃芪甲苷的定量限為0.054 5μg。

精密度試驗(yàn)：取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測定。結(jié)果連翹苷峰面積的RSD為0.62%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為20200527）樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，依法測定。結(jié)果連翹苷的平均含量為0.174 1 mg/mL，RSD為0.92%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為20200527）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，24 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果連翹苷峰面積含量的RSD為1.02%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取同一批（批號為20200527，含量為0.174 1 mg/mL）樣品6份，各5 mL，分別精密加入對照品溶液5 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，依法測定含量，并計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 連翹苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Recovery test of phillyrin（n=6）

2.3.4 樣品含量測定

精密量取3批（批號分別為20200229，20200324，20200527）樣品，各10 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對照品溶液和供試品溶液各進(jìn)樣10μL，依法測定峰面積，按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果樣品中連翹苷的含量分別為0.178，0.188，0.174 mg/mL。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

黃芪的薄層鑒別通過增加氨試液洗滌，以減少酸性組分干擾，結(jié)果黃芪甲苷斑點(diǎn)顯示清晰、分離效果較好。連翹苷屬木脂素類大極性化合物，水溶性好，其薄層鑒別采用水飽和的正丁醇提取，有效提取了有效成分；比較了以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）下層液、氯仿-甲醇（8∶1，V/V）和氯仿-甲醇（5∶1，V/V）作為展開劑的薄層色譜情況，結(jié)果采用氯仿-甲醇（5∶1，V/V）為展開劑，展程達(dá)到15 cm時，連翹苷可完全分離，比移值適中，且斑點(diǎn)顯色清晰。

3.2 色譜條件優(yōu)化

紫外光譜測定發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷溶液與空白溶劑在190～400 nm波長范圍內(nèi)無明顯紫外吸收差異，故HPLC-DAD法不適合測定其含量。參考文獻(xiàn)［11-13］，采用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量，當(dāng)流動相為乙腈-水（32∶68，V/V）時，黃芪甲苷色譜峰可完全分離，且重復(fù)性好，陰性對照無干擾。

采用HPLC-DAD法測定連翹苷的含量，考慮了不同洗脫條件，即乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脫（0～60 min時15%A→45%A，85%B→55%B），乙腈（A）-0.05%磷酸（B）梯度洗脫（0～60 min時15%A→40%A，85%B→60%B）的洗脫效果，結(jié)果連翹苷出峰時間慢（約50 min），系統(tǒng)穩(wěn)定性較差，不利于快速檢測樣品；后又調(diào)整流動相為乙腈-水（25∶75，V/V），結(jié)果連翹苷出峰時間快（約20 min），但與其他峰分離不完全，色譜峰純度未到90%；最后優(yōu)化流動相比例為乙腈-水（20∶80，V/V），結(jié)果連翹苷出峰時間約為30 min，與其他峰完全分離，系統(tǒng)適用性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法重復(fù)性良好。

3.3 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于新冠病毒預(yù)防Ⅱ號方的質(zhì)量評價。