兒咳靈糖漿提取工藝優(yōu)化*

伏東寧，邵 杰

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬連云港市中醫(yī)院，江蘇 連云港222004；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港222001）

兒咳靈糖漿由麻黃、苦杏仁、生石膏、黃芩、鮮竹瀝等15味中藥材制成，是連云港市中醫(yī)院院內(nèi)制劑（批準(zhǔn)文號(hào)為蘇藥制字Z04000017），具有清肺化痰、止咳平喘功效，用于治療上呼吸道感染和急性支氣管炎引起的咳嗽。目前，缺少工藝指標(biāo)，無(wú)法保證大生產(chǎn)的每批產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。現(xiàn)行制劑工藝中苦杏仁采用溫水浸泡24 h后加熱蒸餾，收集蒸餾液。文獻(xiàn)［1-3］報(bào)道，沸水提取比常溫浸泡更能提高苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率。本研究中探討了苦杏仁和麻黃等14味藥材提取過(guò)程中的主要影響因素，以苦杏仁苷、麻黃堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率和干浸膏得率為指標(biāo)性成分，優(yōu)化兒咳靈糖漿的制備工藝，為其大生產(chǎn)提供參數(shù)指導(dǎo)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZTW型調(diào)溫電熱套（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）；FA1104型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，精度為0.1 mg）；AS30600B型超聲波清洗器（功率為600 W，頻率為40 kHz）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥

麻黃、苦杏仁、黃芩等14味藥材均由連云港和興堂飲片廠提供，經(jīng)連云港康濟(jì)大藥房連鎖有限公司吳舟執(zhí)業(yè)藥師鑒定為正品；苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)為110820-201303，含量以99.6%計(jì)），鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)為171241-201508，含量以98.6%計(jì)），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-201418，含量以99.9%計(jì)），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁提取工藝優(yōu)化

2.1.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［4］

本試驗(yàn)在提取2次的前提下，將藥材煎煮方法（因素A）、加水量（因素B）和提取時(shí)間（因素C）作為考察因素，在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，每個(gè)因素確定3個(gè)水平。以苦杏仁苷含量的3次平均值為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 苦杏仁苷L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test for amygdalin

2.1.2 苦杏仁苷含量測(cè)定［5］

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計(jì)不低于7 000。在此色譜條件下，陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與供試品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

2)溶液制備

對(duì)照品溶液：取苦杏仁苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.402 5 mg的溶液，即得。

供試品溶液：按處方比例稱(chēng)取苦杏仁50 g，粉碎成粗粉，按表2中設(shè)計(jì)水平完成9次試驗(yàn)，合并每次提取液，濃縮至500 mL，作為試驗(yàn)用樣品溶液，供含量測(cè)定用。精密量取試驗(yàn)用樣品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀釋?zhuān)瑩u勻，定容至100 mL容量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of L9（34）orthogonal test

陰性對(duì)照品溶液：按照處方工藝，制備不含苦杏仁的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

3)方法學(xué)考察

圖1 苦杏仁高效液相色譜圖1.amygdalinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of Semen Armeniacae Amarum

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密吸取2)項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋?zhuān)ㄈ荩瑩u勻，得0.040 25，0.080 5，0.161，0.322，0.402 5 mg/mL系列質(zhì)量濃度的苦杏仁苷對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按1)項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得苦杏仁苷對(duì)照品溶液的回歸方程Y=0.068X+0.362（r=0.999 0，n=5）。結(jié)果表明，苦杏仁苷質(zhì)量濃度在0.040 25～0.402 5 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取苦杏仁苷對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.402 5 mg/mL）10μL，按1)項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果苦杏仁苷峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取1號(hào)試驗(yàn)樣品溶液，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，16，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果苦杏仁苷峰面積的RSD為1.25%（n=7），表明供試品溶液在室溫（25℃）條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取1號(hào)試驗(yàn)樣品溶液，依法制備供試品溶液6份，按1)項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果苦杏仁苷峰面積含量的RSD為0.67%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取1號(hào)試驗(yàn)樣品（苦杏仁苷含量為1.25 mg/mL）9份，各5 mL，按相當(dāng)于樣品中苦杏仁苷含量50%，100%，150%的比例加入苦杏仁苷對(duì)照品，平行制備3份，依法制成系列供試品溶液，按1)項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果苦杏仁苷的平均加樣回收率為98.90%，RSD為0.97%（n=9）。

2.1.3 苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率計(jì)算及工藝驗(yàn)證

精密吸取各供試品溶液10μL，按1)項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率=(供試品中苦杏仁苷總量/原藥材中苦杏仁苷總量)×100%。結(jié)果見(jiàn)表2。由表3可見(jiàn)，因素A對(duì)試驗(yàn)有顯著影響（P＜0.01），因素B、因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，各因素對(duì)苦杏仁苷含量的影響效果大小順序?yàn)锳＞C＞B。最佳提取工藝為A3B1C2，即苦杏仁沸水入藥，加6倍量水，煎煮2次，每次1 h。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Rusults of ANOVA

2.2 麻黃、黃芪提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)將加水量(因素A)、提取時(shí)間(因素B)和提取次數(shù)(因素C)作為考察因素，在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，每個(gè)因素確定3個(gè)水平。以鹽酸麻黃堿、黃芩苷含量的3次平均值為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表4。

表4 鹽酸麻黃堿、黃芩苷L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Tab.4 Factors and levels of L9（34）orthogonal test for ephedrine hydrochloride and baicalin

2.2.2 鹽酸麻黃堿含量測(cè)定

1)色譜條件［6］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（3∶97，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計(jì)不低于3 000。在此色譜條件下，陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與供試品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖2。

2)溶液制備

對(duì)照品溶液：取鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.520 mg的溶液，即得。

供試品溶液：將2.1.1項(xiàng)下苦杏仁沸水提取過(guò)濾后的藥渣，按處方比例投入麻黃等13味藥材中加水提取，合并煎液，濾過(guò)，靜置，取上清液濃縮至500 mL，作為試驗(yàn)用樣品溶液，供含量測(cè)定用。精密量取試驗(yàn)用樣品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀釋?zhuān)瑩u勻，定容至10 mL容量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按照處方工藝，制備不含麻黃的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

3）方法學(xué)考察

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密吸取2）項(xiàng)下鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，搖勻，制成系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各10μL注入高效液相色譜儀，按1)項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液的回歸方程Y=0.299X+0.205（r=0.999 4，n=5）。結(jié)果鹽酸麻黃堿進(jìn)樣量在0.520～5.200μg范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液10μL，按1）項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果鹽酸麻黃堿峰面積的RSD為0.88%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖2 麻黃高效液相色譜圖1.ephedrine hydrochlorideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of Ephedra sinica

圖3 黃芩高效液相色譜圖1.baicalinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of Scutellaria baicalensis

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取1號(hào)試驗(yàn)樣品溶液10μL，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，16，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸麻黃堿峰面積的RSD為0.85%（n=7），表明供試品溶液在室溫（25℃）條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取1號(hào)試驗(yàn)樣品溶液，依法制備供試品溶液6份，按1）項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果鹽酸麻黃堿峰面積含量的RSD為1.67%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取1號(hào)試驗(yàn)樣品（鹽酸麻黃堿含量為2.65 mg/mL）9份，各5 mL，按相當(dāng)于樣品中鹽酸麻黃堿含量50%，100%，150%的比例加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品，平行制備3份，依法制成系列供試品溶液，按1）項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果鹽酸麻黃堿的平均加樣回收率為97.80%，RSD為0.95%（n=9）。

2.2.3 黃芩苷含量測(cè)定

1)色譜條件［7］與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（47∶53，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)不低于2 500。在此色譜條件下，陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與供試品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖3。

2)溶液制備

對(duì)照品溶液：取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.254 mg的溶液，即得。

供試品溶液［8-9］：精密量取“鹽酸麻黃堿”項(xiàng)下試驗(yàn)用樣品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀釋搖勻，定容至100 mL容量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按照處方工藝，制備不含黃芩的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

3)方法學(xué)考察

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密吸取2)項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋?zhuān)ㄈ?，搖勻，制成系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按1)項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得黃芩苷對(duì)照品溶液的回歸方程Y=0.024X+0.388（r=0.999 5，n=5）。結(jié)果黃芩苷進(jìn)樣量在0.254～2.540μg范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液10μL，按1）項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取1號(hào)試驗(yàn)樣品溶液，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，16，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.56%（n=7），表明供試品溶液在室溫（25℃）條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取1號(hào)試驗(yàn)樣品溶液，依法制備供試品溶液6份，按1）項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果黃芩苷峰面積含量的RSD為1.67%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取1號(hào)試驗(yàn)樣品（黃芩苷含量為8.74 mg/mL）9份，各5 mL，按相當(dāng)于樣品中黃芩苷含量50%，100%，150%的比例加入黃芩苷對(duì)照品，平行制備3份，依法制成系列供試品溶液，按1）項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果黃芩苷的平均加樣回收率為92.60%，RSD為1.45%（n=9）。

2.2.4 干浸膏得率測(cè)定

取正交試驗(yàn)表中樣品溶液，過(guò)濾，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h，置干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算干浸膏得率。

2.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果［10-11］

根據(jù)兒咳靈糖漿制備工藝，將2.1.1項(xiàng)下苦杏仁沸水提取過(guò)濾后的藥渣，按處方比例投入麻黃等13味藥材中加水提取。以鹽酸麻黃堿轉(zhuǎn)移率、黃芩苷轉(zhuǎn)移率和干浸膏得率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行考察。在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定每個(gè)因素的3個(gè)水平，設(shè)計(jì)生成9次試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表5。可見(jiàn)，A因素對(duì)3種考察指標(biāo)的影響最大。根據(jù)表6中各指標(biāo)下最佳工藝水平組合，選擇2個(gè)或2個(gè)以上的相同因素和水平作為優(yōu)選工藝，得出最佳優(yōu)選工藝為A3B1C2，即苦杏仁藥渣與麻黃等13味藥材加10倍量水，煎煮2次，每次1 h。

表5 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.5 Design and results of L9（34）orthogonal test

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱(chēng)取10倍處方量藥材，按2.1.1項(xiàng)下苦杏仁沸水入藥提取最佳工藝條件重復(fù)制備3批，過(guò)濾，濾液備用；藥渣和麻黃等其他13味藥材按2.2.5項(xiàng)下最佳工藝條件重復(fù)制備3批，過(guò)濾，合并濾液。對(duì)苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率及干浸膏得率6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)表7?？梢?jiàn)，通過(guò)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝較穩(wěn)定，可用于兒咳靈糖漿各藥材的提取。

3 討論

麻黃為方中主藥，具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫作用，其主要有效成分為麻黃堿；苦杏仁有效成分為苦杏仁苷，具有鎮(zhèn)咳平喘作用；黃芩主要有效成分為黃芩苷，具有清熱解毒功效［12］。故采用麻黃堿、苦杏仁苷和黃芩苷3個(gè)有效成分作為考察指標(biāo)對(duì)兒咳靈糖漿提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表6 各因素對(duì)考察指標(biāo)的影響分析結(jié)果（%）Tab.6 The influence of various factors on the inspection indicators（%）

表7 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of the verification tests

2017年，江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證審評(píng)中心發(fā)布《關(guān)于對(duì)平喘止咳糖漿等制劑品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高相關(guān)事項(xiàng)的函》(藥事便函〔2017〕117號(hào))，公布兒咳靈糖漿的制備工藝為苦杏仁50 g，溫水浸泡24 h，加熱蒸餾，收集蒸餾液50 mL。文獻(xiàn)［13-14］報(bào)道，溫水條件下，苦杏仁酶會(huì)促進(jìn)苦杏仁苷水解，降低苦杏仁苷含量。故在不改變?cè)兴峁に嚽疤嵯拢黾臃兴胨幪崛『统Ｒ?guī)煎煮（即直接加水煎煮提取）。現(xiàn)行版要求苦杏仁是在溫水浸泡加熱蒸餾后，收集蒸餾液，檢測(cè)苦杏仁苷的含量；另取藥渣過(guò)濾后的濾液檢測(cè)苦杏仁苷的含量。結(jié)果2種溶液都能檢測(cè)出苦杏仁苷的含量，且含量一致，故正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)收集濾液，不再收集蒸餾液。以苦杏仁苷的含量為指標(biāo)，比較3種水提方法進(jìn)行工藝優(yōu)化。預(yù)試驗(yàn)中分別考察了8，10，12倍加水量對(duì)苦杏仁提取效果的影響。結(jié)果表明，加水量增大到12倍，并不能提高苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率。可能是苦杏仁屬種子類(lèi)藥材，吸水率不高。為節(jié)約成本，正交設(shè)計(jì)中加水量因素設(shè)計(jì)為6，8，10倍量3個(gè)水平。考察了提取次數(shù)對(duì)苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果表明，增加提取次數(shù)，并不能提高苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率，故正交設(shè)計(jì)中確定為提取2次。