肝硬化患者外周血miR-122、185的表達 ①

于俊洲，李衛明

(佳木斯市傳染病院，黑龍江 佳木斯 154007)

肝硬化是多種慢性肝病的重要臨床結局。代償期無明顯癥狀，一旦失代償則以門脈高壓和肝功能嚴重損害為特征，病人常因消化道出血、腹水、膿毒癥、肝性腦病、肝腎綜合征和癌變導致多臟器功能衰竭而死亡。代償失代償病人5年生存率分別約84%和14%。代償肝硬化和慢性肝炎的臨床表現相似。通常血常規、肝功[1]等現行的實驗室檢查難以鑒別。B超、CT、核磁共振提示肝表面不光滑、脾厚，均非特異。雖胃鏡可知食道胃底靜脈曲張，但是和肝穿刺活檢一樣存在風險，而且單個肝組織活檢標本不一定能全面反映肝臟整體纖維化程度。需要新的血液生物標志物來鑒別診斷。

基因理論是生物醫學的重心。人類大部分疾病都與基因異常有關。微小核糖核酸是不編碼蛋白質的RNA而參與轉錄后調控[2]，它與mRNA的短的互補序列結合，在轉錄產物的3＇UTR區，即非翻譯區。要么降解產物，要么抑制翻譯過程，最終使靶蛋白降低，產生生理或病理效應。目前，微小核糖核酸是很多疾病診療新的希望。miR-122是肝內特異表達的微小RNA，miR-185是參與廣泛病理過程的微小RNA，國內外對其做了部分研究，但是各家數據不一。鑒于早期肝硬化的及時診斷意義，本院課題組擬對肝硬化的微小RNA作進一步研究。

1 材料和方法

1.1 主要儀器及試劑盒

實時熒光PCR儀(ABI7500)；全自動化學發光免疫分析儀(Mindray)。miRNA熒光定量PCR試劑盒(染料法)；柱式microRNA提取試劑盒；miRNA第一鏈合成試劑盒(加尾法)。

1.2 標本采集

隨機選2018-10～2019-10佳木斯市傳染病院確診代償期肝硬化住院患者48例作為肝硬化組，納入標椎：符合2019年中華醫學會代償期肝硬化診斷依據(符合四條之一)：(1)組織學標椎；(2)內鏡示消化道靜脈曲張，除外非肝硬化門脈高壓；(3)B超或CT提示：脾大、門靜脈內徑≥1.3cm；肝臟硬度測定(LSM)符合診斷界值；(4)符合以下2條：①PLT<100×109/L；②血清白蛋白<35g/L；③INR>1.3或PT延長；④APRI評分>2。另選取41例確診慢性肝炎患者(乙肝26，丙肝8，其他7)作為肝炎組；再選取體檢中心健康體檢者36例作為對照組；以上研究對象均空腹8h后抽取肘靜脈血4管，其中2黃管取血清檢測生化和肝纖維化等指標；1紫管查血常規；1紅管立即送工作臺抽提全部小RNA后，所得溶液置于-70℃保存。

1.3 檢測方法

化學放光免疫分析法檢測血清中透明質酸(HA)和Ⅳ型膠原(CⅣ)等指標，常規檢測生化、血常規。

物品去RNA酶處理，冰上操作。Poly(A)加尾反應和cDNA合成同步進行，所得cDNA于4℃冰箱保存。

冰上配20μL反應體系，每個模板配4個；miR-122-3P,miR-122-5P，miR-185-5P，U6(核內小RNA)。4體系上游引物不同，miRNA122,185為成熟體引物(miRBase)，U6為通用的U6內參的上游引物；下游引物共用；ROX染料校正液；DNA聚合酶；4種dNTP混合液；去RNA酶水等。預變性95℃,30S;變性95℃，5S;退火/延伸，60℃，30S;變性退火/延伸共40個循環，記錄循環閾值Ct，用2-ΔΔCt 計算比率做相對定量。

1.4 統計學方法

采用SPSS17.0對數據分析，完全隨機設計方差分析(單因素方差分析one way ANOV),相關回歸方法描述推斷，P<0.05差異具有統計學意義。

2 結果

匯總分析各組樣本血液指標，前白蛋白、血小板、總膽紅素、球蛋白、總膽汁酸、轉氨酶等提示早期肝纖維化的傾向均不理想，未顯示統計學意義。對比正常組，肝炎組和肝硬化組HA、CⅣ血清含量均升高,全血miR-122表達下降,miR-185表達升高。

肝炎組和肝硬化組比較，HA和CⅣ差異無統計學意義。miR-122-3P、miR-122-5P表達量差異無統計學意義。

肝硬化組合正常組比較，HA和CⅣ差異有統計學意義(P<0.05)；miR-185-5P差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1～3。

圖1 miR-122-3P各組外周血的表達

圖2 miR-122-5P各組外周血的表達

圖3 miR-185-5P各組外周血的表達

對比正常組、肝炎組，肝硬化組HA、CⅣ血清含量升高明顯，而且與miR-185正相關,見圖4～5。透明質酸相關更明顯。

圖4 miR-185與透明質酸相關分析

圖5 miR-185g與Ⅳ型膠原相關分析

3 討論

基因調控是生物表型發生和生物學行為的中心環節[3]，近年發現的miRNA揭示了全新的基因表達調控方式，它在調節那些“轉錄后或翻譯初”修飾的基因起關鍵作用。深入研究miRNA可望觸及生命的本質[4]。血中的豐富的miRNA分子可能作為方便的診斷材料[5]。miRNA可以在組織和血液及其他體液中穩定檢出，對于內環境有公認的作用[6]。微小核糖核酸通常在體液被包裹于細胞外囊泡，例如外泌體、微囊泡，釋放于各類細胞，用簡單方法測量其分布可以作為生化指標[7]。

確定基因型與表型的聯系是個性化的醫學目的。而轉錄的3＇UTR區與微小RNA密切聯系[8]，影響生命過程。微小RNA是新發現的參與基因表達的非編碼RNA，存在于真核生物，其生物學特性是高度保守、時序表達和組織表達特異性[9]，大約19～25個核苷酸，非常之短，傳統的trizol法提取長鏈RNA雖然可以，但是數十個核苷酸的短鏈RNA得率較低，有的反轉錄還用mRNA試劑盒，這樣的短RNA反轉錄成cDNA較困難。本課題實驗采用吸附柱抽提全部的小分子RNA，合成cDNA時再加上polyA腺嘌呤尾，用oligo(dT)胸腺嘧啶與之配對，這樣反轉錄比較容易，根據微小RNA的成熟體序列設計特異引物，最后PCR擴增成功。

透明質酸(HA)廣泛存在與細胞外間隙，主要在肝代謝，肝硬化病人由于成纖維細胞合成HA增加，而肝內皮細胞清除HA障礙，此二者導致血中HA升高，本實驗注意到本采樣部分代償期肝硬化病人血中HA比其他血液指標更敏感，而且與血中miR-185-5P的表達正相關，說明二者可望成為早期診斷肝硬化的生物標志物。

本實驗的不足是，可能肝病樣本較少，比如需要分析肝癌，自身免疫性肝炎，華支睪吸蟲病，其他原因導致的肝損害等的HA和微小RNA的情況，還有miR-122和miR-185的靶蛋白都需要進一步的研究。