臍帶間充質干細胞對小鼠急性肝損傷修復作用的研究 ①

王 琪，柳朝陽，張鵬霞，紀洪兵，殷佳輝，趙德陽，岳 淵，張 濤

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯市傳染病醫院,黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

間充質干細胞(MSCs)具有可塑性及自我更新和分化能力，目前對間充質干細胞研究較多的是骨髓間充質干細胞，但骨髓獲取具有創傷性，經進一步研究發現MSCs具有多種不同來源，幾乎可以在所有的組織中找到，臍帶是一種容易獲得的組織資源，取材簡便沒有創傷性，易于擴增與分離培養[1]。長期保存也具有穩定性，在炎癥組織損傷和某些癌癥疾病中作為組織再生的主要基質[2]。經證實，間充質干細胞可分泌大量具有免疫抑制作用的生物活性因子，這為異基因間充質干細胞的治療提供了理論基礎[3]。本研究對臍帶間充質干細胞進行分離培養及鑒定，并通過對小鼠腹腔注射脂多糖造急性肝損傷模型，隨后腹腔注射MSCs對急性肝損傷小鼠進行治療，從而對臍帶間充質干細胞修復肝功能的能力進行全面研究。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗動物為6周齡雄性小鼠(北京華阜康生物有限公司)。臍帶間充質干細胞培養所用的試驗動物由中國農業科學院畜牧獸醫研究所昌平試驗基地提供，取3月胎齡的流產胎牛，選取臍帶組織放置于含雙抗的無菌PBS磷酸鹽緩沖液中待用。

1.2 主要試劑

DMEM/F12 基礎培養基，自制PBS，胎牛血清和山羊血清均購自美國Gibco公司，雙抗(青霉素、鏈霉素)均購買于北京中杉金橋。一抗購自北京博奧森公司，FITC標記兔抗小鼠，購自北京康為試劑公司。Trizol試劑購買于Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。

1.3 方法

1.3.1 全培

DMEM/F12基礎培養基(按說明書配置)，胎牛血清10ng/mL，bFGF10ng/mL，EGF10ng/mL，1%丙酮酸那，1%非必須氨基酸，1%青鏈霉素(雙抗)，混勻后除菌(濾膜)放冰箱待用。

1.3.2 臍帶間充質干細胞的分離培養

組織貼壁法培養胎牛臍帶間充質干細胞75%乙醇噴灑流產胎牛胎盤消毒，無菌條件下用高壓滅菌后的眼科鑷子和眼科剪將胎盤解剖選取臍帶組織，放入到含1%雙抗的無菌預冷PBS中,隨后轉移至紫外照射15min的無菌超凈工作臺上，將血管和其他組織剔除干凈，于PBS中反復漂洗8～10遍去除血細胞。將臍帶剪為2mm×2mm左右的組織塊, 均勻的貼在培養皿底面, 加入1mL的胎牛血清保持臍帶組織濕潤與貼壁, 將培養皿轉移至37℃、5%CO2細胞培養箱中, 放置1h后，加入3mL全培，靜止3d后每隔兩天換液一次，當細胞爬滿皿底2/3即消化傳代。

1.3.3 免疫熒光堅鑒定間充質干細胞

取第5代純化后的臍帶間充質干細胞接種到六孔板中，PBS沖洗兩遍后用4%多聚甲醛固定，經TritonX-100通透山羊血清封閉后加入一抗，4℃冰箱避光孵育過夜，次日取出六孔板加入FITC標記二抗，表面標記物為VIM、NES、CD44、CD70、CD90和CD105。PBS洗滌,激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.3.4 動物模型制備

準備54只小鼠分為3組，每組18只小鼠隨機分為細胞移植組，對照組和損傷組，對小鼠進行適應性飼養15d。腹腔注射途徑給小鼠注射10mg/kg礦物油(對照組)和10mg/kg脂多糖(損傷組和細胞移植組)。隨后給細胞移植組小鼠腹腔注射4.6×106/皿臍帶間充質干細胞，選取時間節點為6h，24h，48h處理小鼠。

1.3.5 小鼠血清學和肝組織分析

抽取小鼠全血，低速離心機離心小鼠血液取上層血清，通過血清學檢測對小鼠酶水平進行分析，分別檢測肝功能生化指標ALT、AST、ALP、GGT。通過蘇木精 - 伊紅(HE)染色法評估肝損傷與細胞修復作用。

2 結果

2.1 組織塊貼壁法MSCs的形態學觀察

通過顯微鏡觀察臍帶組織塊貼壁法,在第3天組織塊周圍游離出細胞見圖1A,在分離培養的第10天組織塊周圍爬滿細胞, 細胞形態多為梭形或長梭形，見圖1B ,當細胞貼壁率達到80%時可以消化傳代，傳代后細胞為梭形或長梭形,見圖1C～1F。

A 、B分別為為P0第3天和第10天C、D、E、F為P1～P4

2.2 免疫熒光鑒定

通過免疫熒光法檢測臍帶間充質干細胞表面標志物VIM，NES、CD44、CD73和CD105，見圖2，結果顯示均為陽性表達，證明分離培養出的細胞確實是MSCs，可用于下一步小鼠損傷后的細胞移植治療實驗。

(A、D、G、J為綠色熒光(FITC)胞質染色； B、E、H、K 為 DAPI胞核染色； C、F、I、L為FITC與DAPI的疊加圖)

2.3 小鼠蘇木精 - 伊紅(HE)染色法評估和血清學檢測

2.3.1 細胞移植后小鼠肝臟切片的免疫組織化學分析：細胞移植后48h，做小鼠肝臟切片，用10%福爾馬林固定并用石蠟包埋，做肝臟的組織學分析，用蘇木精-伊紅(HE)染色評估，見圖3。

A為LPS注射48h肝組織切片；B為細胞移植后48h肝組織切片

2.3.2 注射LPS后48h，小鼠表現出嚴重的肝損傷。與未受傷的小鼠(對照組)相比，LPS腹腔注射發生肝損傷的小鼠(損傷組)對比，ALT、AST、ALP、GGT增加，急性時相反應蛋白CRP升高。隨后將臍帶間充質干細胞腹腔注射到急性肝損傷模型小鼠體內，細胞移植后48h ALT、AST、顯著降低，ALP、GGT水平降低，CRP下降，證明臍帶間充質干細胞對急性肝損傷小鼠有治療能力。

3 討論

肝臟暴露于許多因素下，例如藥物、病毒，這些因素可能會導致肝臟病變包括慢性肝炎和肝硬化，肝硬化已成為常見病[4]。在大多數情況下，這些疾病會導致肝細胞癌，最后導致器官衰竭，出現慢性炎癥，纖維化，并且不再具有任何再生能力,肝癌的死亡率居腫瘤第二位[5]。迄今為止，唯一有效的治療方法是肝移植，但由于供體數量有限和器官排斥，因此不能被廣泛應用。另一種治療肝衰竭的方法是干細胞。治療肝損傷的主要干細胞是間充質干細胞(MSCs)，可以從不同來源獲得，例如骨髓[6]、臍帶血[7]、羊水[8]、頭皮組織[9]、胎盤[10]和脂肪組織[11,12]。經統計每年因肝臟疾病死亡的患者被低估，病毒性肝炎和肝膽癌引起的與肝臟有關的發病率和死亡率增加，臍帶間充質干細胞移植后可以改善肝臟功能，這一點已經通過肝臟組織切片及血清學檢測數值的變化得到證實。證明臍帶間存在干細胞移植可能在肝病動物模型和肝病治療的臨床環境中具有廣泛的治療功效，對建立干細胞移植具有重要意義。