L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響的實驗研究 ①

季慶輝,薛 宇,顏 玉,薛 勇,喬曉峰,喬建民

(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

股骨頭(caput femoris)是上部覆蓋關節軟骨2/3圓球的圓形，股骨頭上部稍后有一圓形窩稱為股骨頭凹，其內附著股骨頭韌帶，股骨頭可以從此處韌帶動脈血管(股內側、旋股外側、閉孔、臀上、臀下、髂腰)獲得血供[1]。股骨頭由于外傷及應用皮質類固醇和酗酒引起血供不足或中斷形成股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)，它是骨外科致殘率很高常見病，常用治療包括：①人工關節置換術、②非手術治療、③保髖手術治療、④介入治療四種常用方法進行治療股骨頭缺血性壞死(ANFH)[2]。

富白細胞-富血小板纖維蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF) 凝膠是靜脈采集自體全血，通過無外源性添加劑離心濃縮制備而成[3]。富血小板含有大量生長因子，當激活時可以釋放出來，生長因子具有促進骨和成骨細胞增殖、生長、分化和組織形成作用。L-PRF凝膠是富含兩種自體(白細胞和富血小板)物質纖維生物材料，可以避免三種(免疫排斥、交叉感染、凝血功能障礙)風險出現，激活血小板與纖維蛋白生理性聚合，纖維蛋白網狀結構富有彈性，細胞因子可以相對持久的釋放，因為L-PRF凝膠與生物體生理狀態相似，所以能最大限度發揮組織促進再生、愈合、修復作用[4]。

骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是骨髓成體干細胞參與造血微環境構成，具有①多向分化、②低免疫原性、③取材方便、④擴增迅速、⑤遺傳穩定等五方面主要特點[5]。骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)可以在①組織工程、②細胞、③基因治療等方面進行應用，自體骨髓間充質干細胞(BMSCS)結合纖維蛋白可以促進骨再生修復骨缺損[6]。

L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響實驗研究，主要研究探索L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響，L-PRF凝膠結合BMSCs的臨床治療ANFH提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 實驗動物

新西蘭大白兔正常健康24只, 1/2雌雄，4 月齡，體重(2600±200)g,佳木斯大學實驗動物中心提供新西蘭大白兔[7]。

1．2 試劑與實驗儀器

1．2．1 主要試劑。無水乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，25%戊二醛(山東富山東浩中化工科技有限公司)，乙酸異戊酯(天津市南金化工有限公司)，20%甲酸溶液(上海樊克生物科技有限公司)，DMEM/F12(1:1)培養基(上海源葉生物科技有限公司)，四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，胰蛋白酶(上海第一生化藥業有限公司)，牛凝血酶(上海欣百諾生物科技有限公司)，脂多糖/LPS(大腸桿菌內毒素(lipopolysaccharides)，美國 SIGMA)，甲基強的松龍(Methylprednisolone)(普強蘇州制藥有限公司)[8]。

1．2．2 實驗儀器。常溫高速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)，低溫高速離心機(長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司)，SJ-CJ-2FD 超凈工作臺(蘇潔醫療器械(蘇州)有限公司)，-15～-50℃HX-SD6急速冷凍冰箱(東莞市昊昕儀器設備有限公司)，NIKON科研顯微鏡 Eclipse Ci-E/Ci-L/Ci-S(日本，NIKON)，12號骨髓穿刺針(深圳豐都金屬材料有限公司[9]。

1．3 L-PRF凝膠制備

正常健康新西蘭大白兔后肢脛部皮下靜脈處采血10mL、置于離心管(無菌)中、2500rpm/min(978×g)10min離心、靜置10min取淡黃色中間層、無菌紗布吸取血清、粗制L-PRF 、無菌容器靜置10min、無菌紗布包裹輕輕擠壓殘存血清、靜置5min、L-PRF凝膠[10]。

1．4 BMSCs分離培養

在健康正常新西蘭大白兔雙側髂后上棘處用12號骨髓穿刺針抽取骨髓5mL、放入DMEM/F12(1:1)培養基制成懸液、收集培養基中細胞加入2倍PBS(磷酸緩沖鹽溶液)混勻、1500rpm/min,20min離心、離心分層取中間層云霧狀細胞、10cm細胞培養皿、100mL/L胎牛血清培養液、接種2×105云霧狀細胞、取貼壁純化細胞、分離純化BMSCS細胞液、稀釋1×106/mL BMSCS細胞液備用[11]。

1．5 ANFH兔模型制備

健康新西蘭大白兔、第一次經兔耳緣靜脈注射10μg/kg大腸桿菌內毒素(lipopolysaccharides)、間隔24h、第二次經兔耳緣靜脈注射10ug/kg大腸桿菌內毒素(lipopolysaccharides)、然后兔部臀肌肉注射40mg/kg甲基強的松龍(Methylprednisolone)、共3次、間隔24h/1次、42d X線檢查確定模型制備完成[12]。

1．6 ANFH兔股骨頭檢查

1．6．1 MRI 檢查ANFH兔股骨頭。L-PRF凝膠結合BMSCs等各處理兔常規麻醉、仰臥位，屈曲(上、下)肢且固定、兔股骨頭置MRI檢查線圈中心、各處理分別進行MRI掃描檢查、T2 WI出現(點、片、線)狀高信號、T1 WI 出現(點、片、線)狀低信號、得出相關數據。

1．6．2 定量CT(QCT)檢查ANFH兔股骨頭。L-PRF凝膠結合BMSCs等各處理兔常規麻醉、仰臥位，屈曲(上、下)肢且固定標準件上、對其股骨頭中心定位掃描、測量股骨頭骨質疏松CT值、計算骨密度(BMD[13]。

1．7 組織學檢查

1．7．1 光學顯微鏡組織學檢查

MRI檢查后、L-PRF凝膠結合BMSCs等各處理兔常規處死、雙側股骨頭取材標本、常規石蠟包埋切片、蘇木精-伊紅染色、光學顯微鏡高倍鏡(10×40)、5個高倍視野、計數50個骨陷窩占百分數、計血管數目求平均值、數碼相機拍照[14]。

1．7．2 掃描電子顯微鏡組織學檢查

MRI檢查后、L-PRF凝膠結合BMSCs等各處理兔常規處死、雙側股骨頭取材標本、3% 戊二醛固定與脫鈣、環氧樹酯包埋切片、觀察骨細胞。

1．8 L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響實驗動物分組及修復方法

新西蘭大白兔正常健康24只, 1/2雌雄，4 月齡，體重(2600±200)g，均造雙側ANFH 模型后隨機分為A、B、C、D 4組(各6只)，然后進行移植修復。A：對照組，只進行髓芯減壓；B：L-PRF組，髓芯減壓結合50μg L-PRF凝膠移植同時進行；C：BMSCs組，髓芯減壓結合50μL 1×106/mL BMSCS細胞液移植同時進行；D：L-PRF+ BMSCs聯合組，髓芯減壓結合50 μg L-PRF凝膠+50 μL 1×106/mL BMSCS細胞液移植同時進行[15]。

1．9 統計學方法

2 結果

2．1 L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔各組組織學觀察

通過NIKON科研顯微鏡 Eclipse Ci-E/Ci-L/Ci-S進行組織學觀察，L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔各組組織學觀察情況，見表1。

表1 L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔各組組織學觀察

2.2 L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔空缺骨陷窩百分比影響

L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔各組移植處理28d、56d，空骨陷窩觀察及統計情況如下：移植處理28d：A組：空骨陷窩較多，B組：空骨陷窩與A組相比要少些，C 組：空骨陷窩較少，D 組：空骨陷窩較C 組更少；移植處理56d：A組：空骨陷窩較多，B組：空骨陷窩較A組少，C 組：空骨陷窩稀少，D 組：空骨陷窩與C 組相比更稀少。

各組移植處理統計情況如下：移植處理28d、56d，D 組：空缺骨陷窩百分比明顯低于A 、B 和C 組3組，差異有統計學意義(P<0.05)。L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔空缺骨陷窩百分比影響見表2。

表2 L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔空缺骨陷窩百分比影響

2.3 L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔血管密度影響

L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔各組移植處理28d、56d，股骨頭壞死區新生血管計數統計情況如下：移植處理28d、56d，C、D 組：股骨頭壞死區新生血管數明顯高于A、B組，B組：股骨頭壞死區新生血管數多于A 組，D 組：股骨頭壞死區新生血管數明顯高于C組，各組相比較差異有統計學意義(P<0.05)。L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔血管密度影響見表3。

表3 L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔血管密度影響

2.4 L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔骨密度影響

L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔各組移植處理28d、56d，股骨頭骨密度測量統計情況如下：移植處理28d、56d，B 組與A 組和D 組與C組比較差異有統計學意義(P<0.05)。L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔骨密度影響見表4。

表4 L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔骨密度影響

3 討論

股骨是人體骨骼中最重要部分之一，股骨頭作用非常重要，人的股骨頭幾方面作用：①直立、②行走、③活動、④勞動等方面均需要股骨頭起到的支撐作用。因為股骨頭幾方面起到的支撐作用都要有力度和是支點，所以股骨頭也是骨骼中最容易受傷部位。股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)最常見癥狀：(1)疼痛。部位：①髖關節、②大腿近側、③膝部，可放射至膝部。(2)疼痛分類：①持續痛、②靜息痛。(3)其它疼痛：①骨塌陷致創傷性關節炎、②髖關節肌肉韌帶附著部位慢性損傷性疼痛。(4)髖部活動受影響：①旋轉活動、②痛性、③短縮性跛行。如果發生股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)也對人身心影響最大，是骨科的多發和常見病，相比較骨科其它疾病其致殘率很高。

富白細胞-富血小板纖維蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)凝膠是自體富血小板與白細胞第二代纖維生物濃縮制品。L-PRF凝膠制備過程沒有添加任何外源性物，可以避免三種(免疫排斥、交叉感染、凝血功能障礙)風險出現，因為L-PRF纖維蛋白具有網狀結構，所以其含有細胞因子釋放持久更好滿足臨床需求，L-PRF與生物體生理狀態相似，使用中具有極高安全性，臨床方面具有廣闊的應用前景。

骨髓間充質干細胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)生物體中骨髓含量極少，主要存在生物體①器官間質和結締組織，數量與年齡增加呈反比。其培養方法簡便，另外體外增殖迅速，因為BMSCs可以進行冷凍保存，所以現在細胞及基因治療中已成為種子細胞，臨床方面具有廣闊的應用價值[16]。

實驗研究L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔各組移植處理28d、56d，D組：空缺骨陷窩百分比明顯低于A 、B和C組3組，差異有統計學意義(P<0.05)。

實驗研究L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔各組移植處理28d、56d，股骨頭壞死區新生血管計數統計情況如下：移植處理28d、56d，C、D組：股骨頭壞死區新生血管數明顯高于A、B組，B組：股骨頭壞死區新生血管數多于A 組，D組：股骨頭壞死區新生血管數明顯高于C組，各組相比較差異有統計學意義(P<0.05)。

實驗研究L-PRF凝膠聯合BMSCs對ANFH兔各組移植處理28d、56d，股骨頭骨密度測量統計情況如下：移植處理28d、56d，B 組與A 組和D組與C組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

實驗結果證實L-PRF凝膠結合BMSCs對ANFH兔骨陷窩與血管和骨密度影響實驗研究，B：L-PRF組，髓芯減壓結合50μg L-PRF凝膠移植同時進行；C：BMSCs組，髓芯減壓結合50μL 1×106/mL BMSCS細胞液移植同時進行；D：L-PRF+ BMSCs聯合組，髓芯減壓結合50μg L-PRF凝膠+50μL 1×106/mL BMSCS細胞液移植同時進行均有效果，其中以L-PRF+ BMSCs聯合效果最佳。