氟西汀影響HepG2細胞增殖和凋亡的機制

劉曉慧 馬麗霞 張晶

肝細胞癌是世界上最常見惡性腫瘤之一，是全球第二大與癌癥相關的死亡原因[1]。氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，在臨床上廣泛應用于抗抑郁治療[2]。越來越多的證據表明，氟西汀能夠抑制多種腫瘤生長，誘導肝癌細胞的凋亡[3-7]。本實驗探討氟西汀對HepG2細胞增殖及凋亡影響的分子機制，為氟西汀應用于肝細胞癌治療提供依據。

材料與方法

一、主要材料與儀器

人肝癌細胞系HepG2細胞購自美國ATCC公司；氟西汀購自美國Sigma公司；細胞周期檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自美國Gibco公司；TAKARA 反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM購自大連寶生物工程有限公司；兔抗人Bcl-2單抗、Bax單抗購自美國Cell signaling公司；兔抗人Caspase-3多抗、兔抗人β-actin單抗購自美國abcam公司；辣根過氧化物酶標抗兔二抗購自北京中山金橋有限公司。

二、流式細胞術檢測氟西汀對HepG2細胞周期的影響

應用含有10%胎牛血清的DMEM培養基將HepG2細胞培養至最佳狀態，將處于對數生長期的HepG2細胞吹打成單個細胞，細胞計數后取2×105個細胞鋪種于6孔板中，培養體系為2 mL。孵育24 h細胞貼壁生長后，棄去原培養基，換為2 mL無血清DMEM培養基，同時培養基內給予不同濃度氟西汀，未加藥組為對照組，孵育24 h后收集細胞，應用碘化丙啶染色方法制成流式標本，上機檢測細胞周期。

三、熒光定量PCR法檢測Bcl-2、Bax mRNA表達

(一)細胞培養及處理 將處于對數生長的HepG2細胞吹打成單個細胞，細胞計數后取2×105個細胞鋪種于6孔板中，培養體系為2 mL。孵育24 h細胞貼壁生長后，棄去原培養基，換為2 mL無血清DMEM培養基，同時培養基內給予12.5 μmoL氟西汀，未加藥組為對照組，分別孵育6 h、12 h、24 h。

(二)實時熒光定量反轉錄PCR 使用RNA提取試劑盒從培養的細胞中提取總RNA，紫外分光光度法測定總RNA含量，然后采用20 μL的反轉錄體系，反轉錄成cDNA， 最后用EASY Dilution將cDNA液按100、101、102、103梯度稀釋后，各取2 μL稀釋好的cDNA進行Real-time PCR，檢測目的基因的擴增效率和管家基因(GAPDH)的擴增效率一致。PCR引物序列如下：Bcl-2上游(5′-3′)gAgAAATCAAACAg-AggCCg，下游(5′-3′)CTgAgTACCTgAACC-ggCA；Bax上游 (5′-3′)TgACCTCACTgTgACCTTgACT，下游(5′-3′)TgAgCAATTCCAgAggCAgT。

四、蛋白質印跡法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達水平

根據蛋白提取試劑盒說明書步驟提取蛋白質，BCA法測定蛋白質濃度。配置12%SDS-PAGE分離膠，分離等量的蛋白質，然后將其轉移至PVDF膜上。在10 mL 5%脫脂奶粉中加入10 μL(1∶1 000)一抗(分別為兔抗人Bcl-2單抗，兔抗人Bax單抗，兔抗人caspase-3多抗，兔抗人β-actin單抗)，放搖床上4℃輕搖過夜。過夜后，取出PVDF膜，用1×TBST室溫搖床洗3次，每次30 min。將PVDF膜放入相對應的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)，放搖床上，4℃輕搖2 h；用1×TBST室溫搖床洗3次，每次30 min。將ECL發光試劑A 500 μL與試劑B 500 μL混合后，均勻將PVDF膜浸透，將其包于保鮮膜中，反應5 min。在暗室內取出膠片，放在被保鮮膜覆蓋的PVDF膜上，蓋上X-線片夾板，根據條帶亮度調整曝光時間。取出膠片，常規顯影、定影。膠片經掃描后，用Bio-Rad圖像分析系統分析條帶灰度值，比較各組目的蛋白/內參蛋白的表達量。

五、統計學分析

結 果

一、氟西汀對HepG2細胞周期影響

氟西汀以濃度依賴方式使HepG2細胞停滯于G2/M期。對照組G2/M期細胞與5 μmoL實驗組G2/M期細胞相比差異無統計學意義(t=，P>0.05)。10 μmoL組和12.5 μmoL組G2/M期細胞與對照組比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。各組HepG2細胞不同細胞周期的細胞比例見表1。

二、HepG2細胞不同時間點Bcl-2、Bax的mRNA表達

熒光定量PCR法檢測12.5 μmoL氟西汀處理HepG2細胞0、6、12和24 h后Bcl-2、Bax的mRNA相對表達量并記錄CT值，計算2-△△CT值。結果顯示隨著氟西汀孵育時間延長，HepG2細胞Bcl-2的mRNA表達逐漸降低，各組與對照組相比，差異均有統計學意義(均P<0.05)；而隨著氟西汀孵育時間延長，HepG2細胞Bax的mRNA表達各組與對照組相比，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表2。

三、氟西汀處理HepG2細胞不同時間點Bax、Bcl-2及caspase-3的蛋白表達

12.5 μmoL氟西汀處理HepG2細胞0、6、12和24 h后Bcl-2蛋白表達在12 h開始下降，Bax蛋白表達與對照組相比無明顯變化，Bax/Bcl-2在12 h及24 h蛋白表達明顯低于對照組(均P<0.01)，caspase-3蛋白表達在12 h開始增多，12 h及24 h蛋白表達均高于對照組(均P<0.05)，見圖1，表3。

圖1 蛋白質印跡檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達

討 論

研究表明，氟西汀抑制人肝癌細胞系HepG2增殖可能與影響細胞周期進程有關，誘導HepG2細胞凋亡則可能是通過線粒體途徑實現的。

氟西汀以濃度依賴方式使HepG2細胞停滯于G2/M期，G2/M期是DNA合成和有絲分裂的準備期，在細胞周期進程中有至關重要的作用。本研究發現，G2/M期細胞隨著氟西汀濃度增大而增加，因此氟西汀抑制體外培養的HepG2增殖，可能與氟西汀使HepG2在細胞周期G2/M期積累停滯有關。

細胞凋亡是由多種基因控制的程序性死亡，線粒體在細胞凋亡中發揮舉足輕重的作用。線粒體凋亡途徑是細胞凋亡信號傳導的重要通路，受Bcl-2家族蛋白成員調節[8]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，通過阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中或與細胞凋亡激活因子結合來調節細胞凋亡[9]。Bax是與Bcl-2功能相反的一個基因，能促進細胞凋亡。Bax/Bcl-2比值對決定細胞是否進入凋亡狀態有重要意義[10]。

在線粒體凋亡通路中，DNA損傷、代謝紊亂、藥物誘導等因素可導致線粒體內外膜通透性增加，釋放線粒體凋亡蛋白，包括細胞色素C、凋亡誘導因子等。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子結合，形成復合物，可促進caspase-9前體的自身活化，活化的caspase-9激活caspase-3，導致細胞凋亡，caspase-3的活化是線粒體凋亡信號通路的關鍵環節[11,12]。本研究結果顯示，隨著氟西汀處理時間延長，bcl-2 mRNA和蛋白表達降低，而Bax mRNA和蛋白表達無明顯變化，Bax/Bcl-2及活化的casepase-3蛋白表達增多，說明氟西汀可通過線粒體途徑誘導HepG2細胞凋亡。

表1 各組HepG2細胞不同細胞周期的細胞比例(%，±s)

表2 氟西汀對HepG2細胞Bcl-2、Bax mRNA表達的影響(±s)

表3 Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平灰度比值結果(±s)

本實驗明確了氟西汀體外的抗肝細胞癌作用，闡明了氟西汀可能是通過影響細胞周期進程和下調Bcl-2表達、激活caspase-3，抑制肝癌細胞系HepG2增殖并誘導其凋亡。后期可通過體內實驗進一步研究氟西汀的肝癌抑制作用。