楊木屑酶解液作為碳源制備細菌纖維素的條件優化

（山東恒誠檢測科技有限公司 山東 250000）

1.材料與方法

(1)菌株

木醋桿菌。菌株。山東省微生物重點實驗室保藏。

(2)主要試劑

葡萄糖（北京陸橋），蛋白胨（北京陸橋），酵母粉（北京陸橋），無水磷酸氫二鈉（國藥集團，檸檬酸一水化合物（國藥集團）。

(3)主要儀器

天平、高壓蒸汽滅菌器、生物安全柜、恒溫培養箱。

(4)培養基

楊木屑酶解液的預處理：將楊木屑與蒸餾水按1:20混合加入，調節pH為6，加入纖維素酶液和半纖維素酶液，混合均勻，50℃水浴條件下加熱的時間5h。

種子培養基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉5g，無水磷酸氫二鈉0.5g，檸檬酸一水化合物0.5g。

基礎發酵培養基（g/L）：葡萄糖10，楊木屑酶解液100（ml/L），蛋白胨5g，酵母粉5g，無水磷酸氫二鈉2.4g，檸檬酸一水化合物1.0g，pH6。

(5)產量的測定

用鑷子取出靜置培養數天后培養基表面形成的細菌纖維素，在蒸餾水中小心沖洗數次，直到細菌纖維素表面的菌落和培養基洗凈，然后將洗干凈的細菌纖維素濕膜放入含有0.1mol/L的NaOH溶液的燒杯中，在90℃條件下水浴加熱2h。然后取出細菌纖維素濕膜繼續用蒸餾水沖洗數次，至中性。最后用分析天平稱重。

(6)單因素法優化產酶條件

①不同接種量對發酵產量的影響

將種子液不同接種量分別接種到基礎發酵培養基。30℃的恒溫培養箱中培養6d，然后測定細菌纖維素的產量，篩選出最佳接種量。

②不同濃度的葡萄糖培養基對發酵產量的影響

將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的葡萄糖培養基（其他成分同基礎產酶培養基），其他條件保持不變。

③不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養基對發酵產量的影響

在上述優化條件下，將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養基上，其他條件保持不變。

④培養基的不同初始pH對發酵產量的影響

將種子液按最佳接種量分別接種到不同濃度的無水磷酸氫二鈉和檸檬酸一水化合物培養基（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉采用最佳濃度，其他成分同基礎產酶培養基），并調節至不同的初始pH，其他條件保持不變。

⑤發酵溫度對發酵產量的影響

選用優化后的培養基成分，在不同的溫度下靜置培養，其他條件保持不變。

⑥發酵時間對發酵產量的影響

選用優化后的培養基成分，在最佳發酵溫度下靜置培養不同的時間，然后測定細菌纖維素的產量。

2.實驗結果與分析

(1)不同接種量對發酵產量的影響

在上述條件下，接種量按照體積比分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%進行接種，結果見圖1，細菌纖維素的產量隨著接種量的增加不斷升高，當接種量達到5%時，產量趨于穩定，因此選用5%作為最佳接種量。

圖1 不同接種量對細菌纖維素產量的影響

(2)不同濃度的葡萄糖培養基對發酵產量的影響

在最佳接種量的基礎上進行試驗，結果見圖2，細菌纖維素的產量隨著葡萄糖濃度的增加先增加后下降，當濃度在15g/L時，產量最高，因此選用15g/L作為最佳葡萄糖濃度。

圖2 不同濃度葡萄糖對細菌纖維素產量的影響

(3)不同濃度的蛋白胨和酵母粉培養基對發酵產量的影響

在最佳接種量、最佳葡萄糖濃度的基礎上進行試驗，結果見圖3，細菌纖維素的產量隨著蛋白胨濃度的增加先增加后下降，當濃度在7.5g/L時，產量最高。

細菌纖維素的產量隨著酵母粉濃度的增加先增加后下降，當濃度在7.5g/L時，產量最高，因此選用7.5g/L作為最佳酵母粉濃度。

圖3 不同濃度蛋白胨和酵母粉對細菌纖維素產量的影響

(4)培養基的不同初始pH對發酵產量的影響

圖4 不同初始發酵pH對細菌纖維素產量的影響

在最佳接種量、最佳葡萄糖、蛋白胨、酵母粉濃度的基礎上進行試驗，結果見圖4，細菌纖維素的產量隨著初始pH的增加先增加后下降，當pH為5.5時，產量最高，因此選用無水磷酸氫二鈉2.1g，檸檬酸一水化合物1.2g，調節pH至5.5作為最佳初始發酵pH。

(5)發酵溫度對發酵產量的影響

選用最佳培養基成分，在不同的溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）下靜置培養6d進行試驗，結果見圖5，細菌纖維素的產量隨著發酵溫度的增加先增加后急劇下降，發酵溫度30℃時，仍然產量最高，因此30℃作為最佳發酵溫度。

圖5 發酵溫度對細菌纖維素產量的影響

3.結論

到目前為止，細菌纖維素的合成產量一直受各種因素的影響，而優化其發酵條件是目前主要的研究方向，這對于中式生產或工業生產具有重要的借鑒意義。

本文通過單因素法，對一株木醋桿菌利用楊木屑合成細菌纖維素的發酵條件進行了優化，最終確定了葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g，酵母粉7.5g，無水磷酸氫二鈉2.2g，檸檬酸一水化合物1.2g，pH5.5，發酵溫度30℃，發酵時間5d的發酵條件，其產量較優化前調高了近1倍。