磷肥種類對李氏禾富集銅、鉻的影響及其生理響應

劉昭君，林華*，王義安，覃輝，Kong CHHUON

1. 桂林理工大學環境科學與工程學院，廣西 桂林 541004；2. 柬埔寨技術研究所水文與水資源工程學院，柬埔寨 金邊 12000

李氏禾（Leersia HexandraSwartz）是中國境內首次發現的濕生鉻超富集植物（張學洪等，2006），其具有多年生、繁殖能力強、單位面積生物量大、生長迅速、適合生長在潮濕和水生環境中，且一年內可多次收割等特點。因此，李氏禾是實現植物修復技術的一種理想植物。磷是組成植物體內細胞原生質的元素之一，對植物細胞的生長和增殖有重要作用；且是植物光合作用所需的重要元素，參與能量轉移過程（張存款，2018）。磷濃度影響著光合作用，過高或過低的磷濃度都不利于光合作用的正常進行（楊晴等，2006）。缺磷會導致葉綠素含量降低，最終導致光合速率降低（Jacob et al.，1991；張永麗等，2004）。過量磷會減少植物對銅的吸收或形成Ca-P難溶鹽導致植物缺鈣（陳屏昭等，2004；郭延平等，2002）。

李氏禾作為鉻的超富集植物對銅同樣有超富集效果（滿向甜等，2019）。施加適量的磷對提高生物量和重金屬含量有促進作用（Huang et al.，2018；姚詩源，2019），但不同種類的磷肥的化學性質和作用效果也有所不同，陳青云等（2013）證明不同磷肥種類對蔬菜中重金屬累積有一定的影響，劉昭兵等（2012）證明鈣鎂磷和過磷酸鈣降低水稻莖葉和糙米中鎘含量的效果最好，由此看出磷肥種類對植物對重金屬的累積存在某種作用，但哪種磷肥可最大限度地提高植物累積重金屬的量還需實驗確定。本研究通過比較幾種常見的磷肥對李氏禾生長、重金屬累積以及蛋白質、丙二醛、葉綠素、抗氧化酶等生理響應的影響，來確定效果最佳的磷肥類型，探討可能磷肥種類對李氏禾對銅、鉻累積的影響。

1 實驗部分

1.1 實驗設計

實驗所用的李氏禾采自廣西省桂林市雁山鎮的農戶魚塘邊，未受重金屬污染。采回后選取生長一致的李氏禾用清水清洗凈根部至無淤泥后，然后置于15 cm直徑的圓形塑料瓶中，加入25%全Hoagland營養液，置于人工氣候箱中（光照周期14 h、白天25 ℃晚上20 ℃，相對濕度70%—75%，光照強度7000 Lx）。7 d后進行銅、鉻處理。配制去磷霍格蘭營養液（具體配方見表1）。分別加入4種不同的磷肥：磷酸氫二銨（DAP）、磷酸二氫銨（MAP）、磷酸氫鈣（DCP）、過磷酸鈣（SSP），每種磷肥分別設置 4組處理：A組（無磷，0P，0 mg·L-1），B 組（低磷，1/2P，11.38 mg·L-1）、C組（中磷，1P，22.76 mg·L-1），D組（高磷，2P，45.52 mg·L-1），設置兩組對照組（CK1為無磷無銅鉻培養，CK2為無銅鉻培養），每組處理均采用重鉻酸鉀及五水硫酸銅進行配制成10 mg·L-1Cr(Ⅵ)和10 mg·L-1Cu(Ⅱ)的水溶液進行進行復合處理。每個實驗處理重復3次，每個重復20—25株植物。處理15 d后收獲李氏禾并進行重金屬含量、葉綠素含量、蛋白含量、抗氧化酶活性的測定。在培養期間，每3天添加一次去磷Hoagland營養液以保持營養物質濃度和種類。收獲時，先用自來水沖洗干凈，再用20 mmol·L-1EDTA-2Na浸泡并用超聲波震蕩去除表面附著的重金屬，最后用去離子水清洗。

表1 去磷霍格蘭營養液配方Table 1 The formula of modified Hoagland’s nutrient solution without P

1.2 測定項目與方法

1.2.1 株高、生物量

利用直尺隨機測量（周品成等，2019）李氏禾株高。每盆隨機選10株李氏禾置于烘箱，65 ℃烘干48 h至恒質量（陳方圓等，2020），得到植物干質量，即生物量。

1.2.2 元素含量

收獲時，取培養液并用0.45 μm濾膜過濾，用電感耦合等離子光譜儀（ICP）測定銅和鉻的濃度。將李氏禾根部用去離子水清洗干凈后置于烘箱，溫度調整為105 ℃，時間為30 min，這一步是為了保持植物葉片中化學成分不發生轉變和消耗，通過殺青及時終止植物體內氧化酶的活性，而后溫度調整為75 ℃烘干至恒重，粉碎。利用HNO3-H2O2濕法消解，用ICP測定李氏禾植株根、莖和葉部的Cu含量。

1.2.3 生理指標

葉綠素含量測定采用乙醇勻漿，分光光度法測定，取0.1 g植物葉片鮮樣，在黑暗中加10 mL無水乙醇進行勻漿，10000 g離心10 min，在470、649、665 nm測量上清液的吸光度。根據Dijk et al.（1988）的描述計算葉綠素濃度；

丙二醛（MDA）含量采用Heath et al.（1968）描述的方法，用5%三氯乙酸勻漿，0.67%硫代巴比妥酸（TBA）提取，在波長532、600 nm處測定吸光度；

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍染色法（張志良，2009），595 nm波長下測定；

POD活性采用愈創木酚法（張志良，2009），在波長 470 nm測定；CAT活性采用紫外吸收法（Song et al.，2007），在波長240 nm下測定；SOD活性測定采用氮藍四唑（NBT）光化還原法（張志良，2009），在560 nm波長下測定。每個指標測定進行3個重復。

1.3 統計分析

所有數據采用Microsoft Excel 2019處理，統計分析采用軟件SPSS 24.0 LSD法進行差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 不同種類磷肥對李氏禾生長的影響

株高和生物量是反映植物生長狀態和對重金屬耐性強弱的重要指標。與 0P處理組相比，各磷肥處理組對李氏禾生物量和株高（表2）均有顯著作用。低、中、高磷酸鹽濃度處理組均以 DAP處理組生物量和株高最大，分別達到了6.491、7.406、9.260 g和53.667、56.533、59.067 cm。與0P處理組相比，施用磷肥的李氏禾株高均存在顯著性差異（P＜0.05），且各組間的差異性均達到顯著水平（P＜0.05）。各磷肥處理組的生物量相對于對照顯著（P＜0.05），且各組間的差異性均達到顯著水平。其中 DAP、MAP、DCP處理組間生物量達到極其顯著水平（P＜0.01）。

表2 不同磷肥處理李氏禾的生物量和株高Table 2 Biomass andplant height of L. hexandra with different phosphate treatment

2.2 不同種類磷肥處理對李氏禾富集鉻的影響

由表3可知，施用SSP的處理組的李氏禾對重金屬鉻的富集最高。并在磷質量濃度為 22.76 mg·L-1時達到最大，根、莖、葉中鉻質量分數分別為 828.08、202.00、64.00 mg·kg-1，SSP 組李氏禾地下和地上部分鉻富集量均高于對照和其他磷肥組，且差異性顯著（P＜0.05）。

表3 不同磷肥處理李氏禾根、莖、葉中的Cr含量Table 3 Cr concentration in root, stem and leaf of L. hexandra with different phosphate treatment

2.3 不同種類磷肥處理對李氏禾富集銅的影響

由表4可知，施用SSP的處理組的李氏禾對重金屬銅的富集最高。并在中磷時達到最大，根、莖、葉中銅質量分數分別為 674.125、89.250、57.750 mg·kg-1，SSP組李氏禾地下和地上部分銅富集量均高于對照和其他磷肥組，且差異性顯著（P＜0.05）。

表4 不同磷肥處理李氏禾根、莖、葉中的Cu含量Table 4 Cu concentration in root, stem and leaf of L. hexandra with different phosphate treatment

2.4 不同種類磷肥處理對李氏禾富集銅、鉻的生理響應

如表5所示，施用DAP組的李氏禾葉綠素含量在所有處理組中最高。這是由于氮元素是葉綠素的重要組成元素，可能是由于MAP中氮元素含量最高，這更加有利于李氏禾進行光合作用和葉綠素的合成。在低、中、高磷酸鹽水平下，相比于 0P處理組，DAP組李氏禾葉綠素含量分別增加了49.48%、70.81%和136.08%；與DCP組和SSP組相比分別提高了 28.68%、35.19%、71.51%和22.02%、27.55%、61.52%，并與其他各組存在顯著性差異（P＜0.05）。DCP和SSP中無氮元素，所以相應的葉綠素含量均小于其余含氮元素的兩個處理組。

表5 不同磷肥處理李氏禾葉中的葉綠素含量Table 5 The content of chlorophyll in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

如表6所示，各磷濃度處理組可溶性蛋白質含量均與0P處理組存在極顯著差異（P＜0.01），DAP組李氏禾蛋白質含量在所有處理組中最高，這與葉綠素研究結果相同。在低、中、高濃度磷酸鹽處理水平下，DAP組李氏禾蛋白質含量達到最大，相比于 0P處理組，分別提高了 38.10%、50.00%和84.52%；而SSP處理組李氏禾可溶性蛋白的促進作用最小，相對于 0P處理組，分別提高了 7.23%、20.48%和28.92%。MAP和DCP處理組效果處于以上兩者之間，且隨著磷酸鹽濃度的增加，均出現上升趨勢。

表6 不同磷肥處理李氏禾葉中的蛋白質含量Table 6 The content of protein in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

由表7、8可知，各處理組丙二醛含量均低于0P處理組，其中NH4HPO4處理組在中磷時出現最小值，且與其他處理組間存在顯著性差異（P＜0.05），此時李氏禾細胞受到的損傷最??；在低、中、高磷酸鹽處理水平下，NH4HPO4處理組李氏禾丙二醛含量分別降低了14.10%、19.40%和3.35%，有效的緩解了銅、鉻對李氏禾的傷害。各磷濃度處理組SOD酶活性均與 0P處理組存在顯著差異（P＜0.05），隨著磷濃度增加，低、中、高磷酸鹽處理組 SOD活性先升高后下降，相較于 0P處理組，各種磷肥處理組的李氏禾葉片中的 SOD活性均有提高，其中SSP處理組促進效果最好，分別增加了62.41%、72.07%和24.10%。隨著磷濃度的提升，李氏禾葉片中的 POD酶活性呈現出上升的趨勢，在磷質量濃度為22.76 mg·L-1時葉片中POD酶活性達到最大，此后呈明顯下降趨勢，在45.52 mg·L-1時POD酶活性減小。與0P處理組相比，SSP處理組的促進效果最好，當磷質量濃度為22.76 mg·L-1時均達到最大，分別增加了 37.81%、73.76%、38.82%。所有處理組中 CAT酶的活性都隨磷濃度增加出現先增后降的趨勢，且SSP處理組均達到最大，與0P處理組相比，SSP處理組李氏禾CAT酶活性分別增加了25.64%、43.23%和21.75%。

表7 不同磷肥處理李氏禾葉中的丙二醛含量和SOD活性Table 7 The content of MDA and the activity of SOD in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

表8 不同磷肥處理李氏禾葉中的POD、CAT活性Table 8 The activity of POD and CAT in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

3 討論

磷是植物的組成成分之一，也是植物生長過程中的必需元素，在植物代謝、酶活性調節、光合作用等方面都扮演著重要的角色。磷在植物光合作用、呼吸作用和生理生化調節過程中起著重要作用（Rao et al.，1990；賀軍軍等，2016）。在本實驗中，與 0P處理組相比較可知，磷肥處理組李氏禾的株高均存在顯著性差異，DAP處理組的李氏禾株高和生物量最大。隨著營養液中磷濃度的增大，李氏禾株高和生物量都呈上升趨勢，說明施加磷肥明顯促進植物生長。這一結果與Huang et al（.2013）、Singh et al.（2015）和 Dai et al.（2017）的研究一致。DAP和MAP含有利于光合作用的元素氮和磷，相對其他2種磷肥而言更有利于植物進行光合作用，這可能是導致DAP和MAP處理組株高和生物量大于其他兩組的原因（Zhang et al.，2017）。此外，施加磷肥降低了重金屬對植物的脅迫，并有助于葉綠素的形成從而葉綠素增加（Bustingorri et al.，2017；楊晴等，2006）。

植物體內可溶性蛋白大部分是參與植物生理代謝的酶類，可溶性蛋白是重要的生理生化指標，其含量可以反映出植物體總代謝程度（王英，2018），也可以衡量植物在某種條件下是否會發生重金屬脅迫。Hartley et al.（2001）證明砷誘導的氧化應激在植物中引起許多毒性效應，使可溶性蛋白質含量降低。而Kamran et al.（2018）證明加入磷酸鹽可以有效減輕砷的毒性。在本研究中，可溶性蛋白含量隨供磷水平的提高而增加，在磷供給濃度最大時值最高，這與孫海龍（2005）得出的結論相同。DAP和MAP處理組的可溶性蛋白含量均高于其他0P處理組，這可能是因為磷會促進植物對氮元素的吸收，有利于蛋白質的合成，從而提高了葉片可溶性蛋白的含量，可能是適宜磷能促進植物體內銨態氮和硝態氮的同化；磷又可以加強植物的呼吸作用，呼吸作用會形成多種有機酸，從而轉化為氨基酸，使蛋白質含量升高，在進一步合成蛋白質中，ATP又是能量的供應者（馬佩玲，2018）。

作為農業生產中增加產量的一種重要方式，施肥也可用于加強植物修復（廖曉勇等，2007）。Barrutia et al.（2009）報道了施肥極大地刺激了植物的生長并提高了植物富集的效率。Zhou et al.（2020）證明施加磷肥可以有效提高植物對銅的吸收。在本研究中也出現了類似的現象，施加適量的磷肥能有效地增加李氏禾對銅、鉻的富集量，添加過磷酸鈣的實驗組銅、鉻的富集量明顯高于其他處理組，可能是過磷酸鈣水溶液為弱酸性，而重金屬銅、鉻可能在堿性條件下發生了共沉淀作用，導致營養液中有效銅、鉻含量降低，并且pH還可能影響了Ca離子通道轉運銅、鉻。王寶奇（2007）的研究證明隨著土壤pH的升高，重金屬銅鋅共沉淀作用，大多以沉淀態的形式存在于土壤中，有效性顯著下降。田靜等（2014）證明單一元素銅和鉻處理的李氏禾對銅、鉻的吸收與鈣離子通道有關。李氏禾重金屬富集地上部分大于地下部分，相關研究也有類似情況（Zhang et al.，2007；陳俊等，2008）。

當植物處在逆境條件下，會直接或間接形成過量ROS，而ROS對細胞內的膜系統、脂類、蛋白質和核酸等大分子存在破壞作用（鄭榮梁，2007）。丙二醛（MDA）含量越高，說明植物細胞膜質過氧化程度越高，細胞膜受到的傷害越嚴重（李兆君等，2004；王曉維等，2014）。本實驗中，與對照組X相比，在銅、鉻脅迫下MDA含量降低，說明重金屬毒性降低。Dai et al.（2017）證明，施加磷肥能降低鎘脅迫下李氏禾葉片中丙二醛的含量，這與本實驗結果類似。施加磷肥后，抗氧化系統被激發以消除ROS，這與丙二醛含量降低有關（Zhou et al.，2020）。超氧化歧物酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等可清除有害的體內活性氧保護植物細胞免受活性氧的損傷（顧艾博，2014；唐茜等，2009），從而保護植物的膜系統。在植物受到重金屬脅迫時，POD和CAT酶活性會改變，從而間接反映植物受傷害的程度（潘芳慧等，2018）。本實驗中，在低濃度磷脅迫下，各處理組 SOD活性均有所升高，增加其抗性以適應逆境生長環境。SOD和POD酶在低、中、高濃度磷處理時呈現先增后降的趨勢，說明SOD和POD酶在低濃度磷處理時對李氏禾有一定的保護作用，在高濃度磷處理時，活性氧和抗氧化系統平衡被破壞，從而被抑制。

4 結論

施用不同磷肥能明顯提高銅、鉻污染土壤上生長李氏禾的生物量，其中以施用DAP的效果最好。磷肥的施用對李氏禾吸附銅、鉻均有促進作用，施用SSP的李氏禾各部分銅、鉻積累量均高于其他3種磷肥。施用磷肥減弱了銅、鉻對李氏禾的脅迫，施用DAP的李氏禾葉片中葉綠素含量遠高于其他3組。

李氏禾葉片中的丙二醛隨磷濃度的變化而變化，其中SSP處理組對李氏禾的影響最大。當植物遭受重金屬脅迫時，植物的代謝活動會受到影響，施用SSP時李氏禾葉片中的SOD、POD、CAT含量均在磷質量濃度為22.76 mg·L-1時達到最大。