基于GGE雙標圖和BLUP分析篩選鎘砷同步低累積水稻品種

柳賽花，紀雄輝，謝運河，劉昭兵，田發祥，潘淑芳

湖南省農業環境生態研究所/湖南省農業科學院，湖南 長沙 410125

隨著經濟的發展和城市化進程的加快，鎘砷等重金屬高含量復合伴生進入土壤系統，嚴重威脅生態環境和人類健康，2014年全國土壤污染狀況調查公報顯示全國鎘（Cd）和砷（As）點位超標率分別為7.0%和2.7%。Cd是一種生物蓄積性強、毒性持久、具有“三致”作用的劇毒元素，攝入過量鎘對人體危害極其嚴重He et al.（2013）。As是一種慢性毒性的類金屬，通過食物與飲用水暴露途徑對人體健康產生影響，長期接觸砷可以導致肺損傷、外周神經損傷、皮膚病或心血管病，是引起多種癌癥的因素之一（Abernathy et al.，1999）。水稻具有富集重金屬Cd的特點，是吸收Cd能力最強的大宗谷類作物之一（Chaney et al.，2004），且水稻也是中國受As污染的主要糧食作物之一，如中國人均As攝取量約為 42 μg·d-1，中國成年男子的膳食中總As的攝人量遠遠高于美國、加拿大和澳大利亞等國家，其中通過大米攝人的As占總As攝人量的60%（Li et al.，2011），較高的稻米鎘砷含量使得以稻米為主食的居民健康受到嚴重威脅（Stroud et al.，2011；Zhou et al.，2018）。

大量報道認為，不同的水稻品種對Cd、As的吸收和累積能力存在顯著差異（Chen et al.，2018；Duan et al.，2017），目前國內外水稻鎘砷低吸收品種篩選與遺傳改良的研究較多，有研究表明水稻鎘砷低吸收品種能有效降低稻米鎘20%—50%，在鎘污染土壤中種植低鎘水稻品種能使稻米鎘含量低于國家限量標準（0.20 mg·kg-1）（Mu et al.，2019），在孟加拉等地的300多個水稻品種大田試驗中，篩選出了76個砷低累積品種（Norton et al.，2012），可見應用重金屬低累積水稻品種已是目前控制水稻鎘或砷吸收累積的有效措施之一（單天宇等，2017）。在鎘砷復合污染土壤環境中，由于鎘砷不同的化學性質，使得稻米鎘砷含量呈負相關關系（Duan et al.，2017），但因稻米鎘砷含量除了受品種影響外，環境對稻米鎘砷含量影響至關重要，占稻米鎘砷差異來源的87%（Chi et al.，2018），從而使得稻米鎘砷同步低累積存在可能。因此本研究選取湖南省瀏陽七寶山礦區典型鎘砷復合污染稻田土壤，利用基因型主效加基因型-環境互作效應（GGE）雙標圖分析了 18個湖南省應急性鎘低累積水稻品種的鎘砷低累積性、穩定性、適應性和環境相關性，利用最佳線性無偏預測（BLUP）法計算不同品種稻米鎘砷含量育種值，為篩選鎘、砷及鎘砷同步累積水稻品種提供一種新方法，為鎘砷同步低累積水稻品種的選育及推廣提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗品種

試驗1、2、3中的品種為湖南省應急性鎘低累積水稻品種，總計18個，具體名稱見表1。

表1 試用所用的水稻品種Table 1 Directory of cultivated rice cultivars

1.2 試驗地點和試驗設計

試驗 1：在湖南省農業科學院內網室進行，采用盆栽試驗，每一品種設置為一個處理，18個品種即為18個處理，每個處理5個重復。選用直徑約為15 cm的塑料桶，共計80桶，每桶裝5 kg土壤，供試土壤采自湖南省瀏陽市永和鎮佳成村，為花崗巖發育的麻砂泥0—20 cm耕層水稻土，肥料分別為尿素、磷酸鈣和氯化鉀的形式按N—P—K以150—90—135 kg·hm-2的量加入，加入肥料充分混勻隨機區組排列，設置保護行加自來水浸泡7 d后種子直播，2周后追施一次尿素，用量為N 0.08 g·kg-1灌溉使用自來水，其 pH 6.91，重金屬鎘含量未檢出。水分管理采取分蘗末期和成熟期2次曬田，病蟲害防治與大田相同。

試驗 2：在瀏陽永和鎮的鎘砷污染稻田開展早稻季大田試驗（28°29′N，113°89′E）。于 3 月 23 日育秧，4月19日移栽，根據不同品種的成熟時間于7月4日—8月9日收獲。采用隨機區組設計，每小區為一個品種，6行10列，每個品種3個小區重復，且周邊設置0.5 m的保護行。水分管理采取分蘗末期和成熟期2次曬田，肥料管理按照當地管理方式進行。

試驗 3：在瀏陽永和鎮的鎘砷污染稻田開展晚稻季大田試驗。于6月12日育秧，7月3日移栽，根據不同品種的成熟時間于9月18日—10月10日收獲。隨機區組設計及水肥管理同試驗 2。3個試驗的土壤pH和鎘砷含量見表2。

表2 試驗土壤的pH土壤鎘砷含量Table 2 pH and contaminant concentrations of soil inpot experiment and field sites

1.3 樣品處理和測定

水稻于成熟期取樣，稻谷經曬干后去殼粉碎，過100目尼龍篩待測。稻米中總鎘和總砷測定采用微波消解，稱取0.5000 g植物樣品，加入5 mL HNO3和2 mL H2O2，利用微波消解儀消解，超純水定容至100 mL，用ICP-MS測定總Cd、As濃度。樣品分析中所用試劑均為優級純，并添加國家標準參比物質（大米：GSB-22）為內標進行質量控制，分析器皿均以5%硝酸溶液浸泡過夜，以去離子水洗凈。

1.4 數據統計與處理

試驗數據用Excel 2007和SPSS 19.0進行統計分析和作圖，采用GGE-Biplot分析水稻品種的低鎘砷累積能力和穩產性，采用ASReml計算每個品種關于鎘和砷的育種值。

2 結果與分析

2.1 不同品種稻米中鎘砷含量

從3個試驗來看，均是稻米鎘含量高于稻米砷含量，且稻米鎘砷含量呈顯著負相關關系，-0.10（試驗1）、-0.09（試驗2）、-0.36（試驗3）。從表3中可以看出，試驗1和試驗2、3中稻米鎘砷含量差異明顯，試驗1、試驗2和試驗3中稻米鎘砷含量的算術平均值為 1.61、1.33 mg·kg-1，1.45、0.50 mg·kg-1與 1.13、0.15 mg·kg-1。不同水稻品種中鎘砷含量差異顯著，試驗1、試驗2和試驗3的品種間稻米鎘砷含量變幅分別為21.1、12.8倍，1.7、3.7倍與2.4、9.0倍，其變異系數分別為1.0和1.0、0.3和0.2與0.3與0.1。

表3 3個試驗的稻米鎘砷含量Table 3 Heavy metal concentrations in different cultivars of rice grains in 3 tests

方差分析結果表明（表4），品種、環境及品種與環境互作對稻米鎘砷含量影響都達到極顯著水平。在盆栽和大田試驗的方差分析來看，稻米鎘差異來源主要受品種與環境互作的影響，占總影響的45.4%，稻米砷差異主要受環境和品種與環境互作的影響，分別占總影響的39.8%和33.6%。從早晚季試驗的方差來看，品種、環境及品種與環境互作對稻米鎘含量的影響均大，分別為 32.4%，24.1%和25.7%，而稻米砷的主要差異受環境影響較大，占整體影響的59.9%。

表4 稻米鎘砷含量差異方差分析Table 4 Analysis of variance for grain Cd and As concentrations from 18 rice cultivars grown at pot and field in two seasons

2.2 品種稻米鎘砷低累積能力及其穩定性

圖1中的小圓圈代表平均環境，通過原點和平均環境且帶箭頭的直線為“平均環境軸”。“平均環境軸”的箭頭所在的位置代表品種在所有環境下稻米鎘或砷的近似平均含量，越往箭頭方向含量越低；與平均環境軸垂直并通過原點的直線代表各品種與各環境相互作用的傾向性，越偏離“平均環境軸”越不穩定。以“平均環境軸”上的箭頭為圓心畫圓，越靠近中心圓的品種，其稻米鎘砷低累積能力越強且越穩定。由圖1可以看出，稻米鎘低累積能力和穩產性較好的品種為14，其次是15和9等，表現比較差的品種為10、13和8等。稻米砷低累積能力和穩產性較好的品種為9，其次是14、17等，表現比較差的品種為5、1和12等。

圖1 GGE雙標圖分析品種的稻米鎘砷低累積能力及其穩定性Fig. 1 The comprehensive ranking view of the GGE biplot for rice cultivars

2.3 不同品種的適應性

將最外面的品種順序連接起來形成一個多邊形，過原點向各個邊做垂線，這樣多邊形就被分成多個扇形區域，多邊形的頂點為所在區域表現最好的品種，而位于多邊形內、靠近原點的品種是對環境變化不敏感的品種，藍色圓圈是根據環境進行生態型劃分。圖2可以看出，GGE雙標圖的PC1和PC2可以有效的解釋G（基因）和GE（基因×環境）互作的對鎘砷影響94.75%和99.65%的變異，可以解釋絕大部分的變異，具有較強的代表性。對鎘而言，3個環境整體分為一個生態型，而品種14是該生態型中表現最好的品種。對砷而言，3個環境整體分為3個生態型，品種4是環境2表現最好的品種，品種9是環境1表現最好的品種。

圖2 GGE雙標圖分析品種的適應性Fig. 2 Adaptability view of the GGE biplot for rice cultivars

2.4 試驗環境的相關性

環境相關性評價可以直觀的分析各試點對品種評價的相似性，連接原點和各環境的直線稱為向量，兩環境向量夾角的余弦值近似于它們的遺傳相關系數，夾角越小說明環境對于參試品種的排序越相似，夾角小于90度為正相關，大于90度為負相關。環境之間不相關或者負相關表示這些環境屬于不同的類型區，因此，根據稻米鎘和砷含量的環境相關性評價可以看出（圖3），環境2和環境3夾角較小，生態比較相似屬于同一區域，環境1為另一區域。

圖3 GGE雙標圖分析環境相關性Fig. 3 Envrionment vector view of the GGE biplot for rice cultivars

2.5 品種鎘砷的綜合育種值

根據表5中稻米鎘砷含量的最佳線性無偏預測（BLUP）值可知，稻米鎘含量育種值排名前5的品種分別為 14＞15＞9＞8＞16，稻米砷含量育種值排名前 5的品種分別為 9＞7＞14＞16＞13，稻米鎘砷含量綜合育種值排名前5的品種分別為14＞9＞15＞16＞8。

表5 不同品種稻米鎘砷BLUP值Table 5 Cadmium and arsenic BLUP values of different rice cultivars

3 討論

在重金屬污染稻田種植低累積水稻品種是中國農田糧食安全生產的一項有效措施，但不同品種稻米鎘砷含量差異很大，如Duan et al.（2017）報導在中國華南地區471個當地主栽高產品種稻米鎘砷含量差異達32、4.0倍，Mu et al.（2019）發現在中國四大糧食產區總計687個大米樣品的稻米鎘砷含量差異分別為 0.004—1.38、0.011—0.235 mg·kg-1，這為中國受污染耕地水稻安全生產提供大量鎘砷低累積水稻種質資源。

一般而言，水稻品種稻米Cd/As含量差異與水稻生長發育過程中Cd/As吸收轉運遷移的難易程度不同有關，水稻Cd/As吸收轉運通道和路徑的不同均會造成不同水稻品種 Cd/As吸收累積差異（Ishimaru et al.，2012；Kamiya et al.，2013），另外，稻米Cd/As含量易受土壤pH、土壤Cd有效態含量、水分含量等環境影響（Cao et al.，2014；Li et al.，2018），多點試驗證明環境不僅對水稻產量影響至關重要，對稻米鎘砷含量影響也很大（Mu et al.，2019），Chi et al.（2018）研究表明年度降雨不均衡會造成早稻鎘含量低于晚稻稻米，而早稻稻米高于晚稻稻米。何洋等（2016）研究表明溫度是影響水稻籽粒鎘積累的重要因子，不同生育時期溫度變化導致糙米鎘含量的變化。從本研究稻米鎘砷含量差異分析結果看出，在盆栽和大田環境差異較大的情況下，稻米鎘差異主要受環境與品種交互作用影響，占總影響的45.4%，而稻米砷則更易受環境影響，占39.8%。因此借助一定的數學模型方法綜合評價品種、品種與環境交互作用對稻米鎘砷低累積能力及其穩定性影響，進而得到鎘、砷和同步鎘砷低累積品種用于指導中輕度重金屬污染稻田的安全生產具有重要意義。

目前對于低累積品種的確定，主要是通過盆栽篩選、多點大田篩選和不同地區大田驗證，根據各試驗點平均鎘含量、超標試驗點數和重復次數綜合評價方法進行低累積品種評價（張玉燭等，2017），GGE模型是同時考慮基因型效應和基因與環境互作效應的模型，它使用雙標圖的形式展示基因與環境互作，提供鑒別品種高產和穩產性及品種的環境適應性分析。目前主要用于水稻（王磊等，2015）、花生（郭敏杰等，2017）、玉米（孟令聰等，2019）、大豆（昝凱等，2019）和大麥（趙鋒等，2019）等品種的區域豐產優質、穩定性及適應性的評價，顯少用于對水稻品種鎘砷低累積能力及其穩定性的評價，鑒于 GGE本身針對的是表型數據高的品種篩選，因此本研究通過對不同品種稻米鎘砷含量數據進行標準化處理并負數化的數據轉化后，分析得出稻米鎘低積累品種為 14、15、9，稻米砷低累積品種為9、14、17。GGE分析提供圖形直觀地表達，可幫助我們分別評價參試品種稻米低鎘或低砷累積能力及其穩定性，但不能綜合多個性狀同時評價，另外品種數量和點位數量較多的情況下，圖形中的點位和品種數據可能重疊而影響其評價判斷。因此在多性狀同時評價的情況下，在計算單一性狀BLUP值的基礎上，運用綜合BLUP值進行評價。BLUP法具有估計值無偏、估計值方差最小、可消除因選擇和淘汰等原因造成的偏差等特性，是當今世界范圍內主要的種畜遺傳評定方法（李晶等，2020；鄭聰慧等，2019），暫無用于對水稻稻米鎘砷低累積能力遺傳評價，本研究通過計算稻米鎘和砷含量單一性狀的BLUP值，稻米鎘和砷含量單一性狀各賦予一個權重 0.5，計算出稻米鎘砷含量綜合BLUP值，根據其排名可直接得出稻米鎘砷含量同步低累積的品種，最優的同步低累積品種為品種14，其次是品種9，和GGE模型評價的結果基本一致。本研究3個試驗點的地點一個為盆栽，另外兩個為早稻季和晚稻季相鄰大田，雖然本研究中的試驗地點代表性有待加強，但通過 GGE雙標圖和BLUP分析多環境試點中品種的鎘砷低累積能力及穩定性和篩選多環境試點的鎘、砷及鎘砷同步累積水稻品種是一種可行的新方法。

4 結論

3個試驗中稻米鎘砷含量差異顯著，稻米鎘含量為 0.20—4.21mg·kg-1，稻米砷含量為 0.03—4.24 mg·kg-1，稻米鎘差異來源主要受品種與環境互作的影響，稻米砷受環境影響較大。通過 GGE雙標圖篩選出適宜不同環境種植的低鎘品種和低砷品種分別是品種14（Y兩優19）、15（深兩優5814）和9（晶兩優華占），稻米砷低累積品種為品種 9（晶兩優華占）、14（Y兩優19）和17（望兩優5511），進一步通過BLUP分析得出鎘砷同步低累積品種為品種14（Y兩優19）和9（晶兩優華占），和GGE模型評價的結果基本一致。總的來說，利用 GGE雙標圖和BLUP分析篩選多環境試點中的鎘砷低累積水稻品種，可為重金屬污染耕地水稻品種選擇提供科學依據。