不同濃度植物根系分泌物微生態(tài)效應(yīng)研究

沈鳳英 ，吳偉剛，李亞寧，劉大群 ，滕云

1. 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心/河北省植物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

植物在生長過程中由根系不同部位分泌產(chǎn)生的無機離子或小分子有機物統(tǒng)稱為根系分泌物（何為等，2017；章帆等，2018；尹華軍等，2019）。根系分泌物的產(chǎn)生是植物在長期進(jìn)化和生長過程中形成的一種適應(yīng)機制。根系分泌物的產(chǎn)生受外界環(huán)境的影響，而根系分泌物本身對根際環(huán)境具有改變作用（蔣錚等，2018；劉小明等，2018）。關(guān)于植物根系分泌物的研究已有200多年歷史。Syrennius早在1768年就提出植物根系能分泌某種物質(zhì)；隨后，Plenk（1795年）和Decardolle（1830年）觀察到根系分泌物對鄰近植株有促生和抑制作用。20世紀(jì)50年代，有研究揭示了根系分泌物的作用；到20世紀(jì)70年代，根系分泌物的研究出現(xiàn)了蓬勃發(fā)展的趨勢。近年來的研究表明，根系分泌物是保持根際生態(tài)系統(tǒng)活力的關(guān)鍵因素，也是根際微生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)遷移和調(diào)控的重要組成部分（Tian et al.，2019；Zhang et al.，2019；María et al.，2020）。

根系分泌物是健康植株在一定生長狀態(tài)下，由根系通過分泌或溢泌作用釋放到根際環(huán)境中的具有一定溶解性有機物的總稱，是植物與外界環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)、信息交流的重要載體和通訊物質(zhì)（劉艷霞等，2016；王婷等，2018；張文明等，2018；字淑慧等，2019）。常作為化感物質(zhì)影響植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量、土壤酶活性及理化性狀等，進(jìn)而影響植物生存環(huán)境的物理、化學(xué)和生物學(xué)性狀（Chang，2019；Holz et al.，2019；Lv et al.，2020）。土壤中的微生物是生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動力，其潛在的生物化學(xué)活性對土壤發(fā)揮其生態(tài)功能有重要意義；同時，由于植物根系的分泌物中包含有大量的有機物質(zhì)，為土壤中的微生物提供了碳源，使得土壤中的微生物群落組成及數(shù)量不同于根外土壤，而土壤微生物直接參與土壤中氮、磷等養(yǎng)分物質(zhì)的循環(huán)和轉(zhuǎn)化，它的代謝產(chǎn)物也影響著植物的定植、生長、繁殖和群落演替，因而土壤微生物的數(shù)量和種類構(gòu)成對評價土壤養(yǎng)分和肥力狀況有重要意義（王吉秀等，2016；孫燕等，2017；王婷等，2018）。目前，國內(nèi)外關(guān)于根系分泌物的研究主要集中在農(nóng)作物連作障礙、農(nóng)田肥力、重金屬污染等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，而對園林植物根系分泌物及其生態(tài)功能的研究相對較少（唐希望等，2018；張建聰?shù)龋?019）。本研究以夾竹桃（Nerium oleander）為對象，通過水培法收集種植物的根系分泌物，將收集的分泌物原位土壤培養(yǎng)。分析其對土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落功能多樣性、微生物量碳、微生物熵、基礎(chǔ)呼吸和代謝熵的影響，以期為深入揭示園林植物根系分泌物的形成機理，為園林植物的大力推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

園林植物選擇夾竹桃（Nerium oleander）（城市道路長勢較好的100株夾竹桃，高度約為3 m），將采集到的夾竹桃根系清洗干凈后置于Hoagland完全營養(yǎng)液中復(fù)性3 d（增氧泵通氣）。復(fù)性后的根系用1% NaClO消毒15 min，用無菌水沖洗干凈后定植于1000 mL的燒杯中，加無菌水使根部全部浸沒。在室溫條件下分別培養(yǎng)6、12、24 h后將根系取出（記錄液體體積），燒杯中的液體即為夾竹桃根系不同收集時間段的分泌物收集液。收集液經(jīng)過濾后，減壓濃縮10倍后低溫密封保存。同時采集夾竹桃根區(qū)新鮮土壤，4 ℃保存后用于測定土壤微生物特性。

1.2 根系分泌物回接土壤

分別取上述根系分泌物濃縮液10 mL，加入80 g過1 mm篩的原位土中，置于100 mL螺口玻璃瓶中，密封，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3周。試驗共設(shè)4個處理[低濃度LC為5 mL分泌物+10 mL去離子水；中濃度MC為10 mL分泌物+5 mL去離子水；高濃度HC為15 mL分泌物；并以15 mL去離子水作為對照(CK)]，每種處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3 土壤有機碳、微生物量碳及基礎(chǔ)呼吸測定

土壤有機碳（SOC）采用重鉻酸鉀外加熱法測定。在外加熱的條件下（油浴溫度為180 ℃，沸騰5 min），用一定濃度的重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化土壤有機質(zhì)（碳），剩余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵來滴定，從所消耗的重鉻酸鉀量，計算有機碳的含量（譚雪蓮等，2018）。

土壤微生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸提取法測定。準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于烘干土樣10 g的新鮮土樣，放入真空干燥器中，同時分別放入裝有NaOH溶液和無乙醇氯仿的小燒杯，用真空泵抽成真空并保證氯仿沸騰3—5 min，在25 ℃避光黑暗條件下放置24 h（同時設(shè)相應(yīng)未熏蒸對照土樣），提取過程浸提液采用 0.5 mol·L-1K2SO4溶液（土液比為 1∶4），并用0.45 μm濾膜抽濾，濾液中碳用High TOC Ⅱ+N（Elementar Ⅱ，Germany）測定。MBC以熏蒸和未熏蒸土樣提取液中碳含量的差值 Ec除以轉(zhuǎn)換系數(shù)0.45而得到。

土壤基礎(chǔ)呼吸（BRC）采用培養(yǎng)法測定。稱取相當(dāng)于20 g干土的新鮮土壤放入培養(yǎng)瓶中，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間持水量的60%，在25 ℃條件下培養(yǎng)24 h，CO2產(chǎn)生量使用氣相色譜儀測定，以單位時間內(nèi)產(chǎn)生CO2-C的量表示基礎(chǔ)呼吸大小。微生物代謝熵為基礎(chǔ)呼吸和微生物量碳的比值（王吉秀等，2016；孫燕等，2017；王婷等，2018）。

采用Biolog Eco微平板法進(jìn)行微生物群落多樣性的測定。每塊微平板含3組各32孔，其中1孔為不含任何碳源的對照，其余31孔各含有1種碳源和氧化還原染料四氮唑藍(lán)，底物利用后產(chǎn)生氧化還原電勢的變化可導(dǎo)致染料顏色發(fā)生變化。稱取5 g不同處理的土樣置于50 mL無菌生理鹽水中，180 r·min-1振蕩30 min，然后用無菌生理鹽水稀釋至10倍，通過排孔加樣器接種至Biolog微平板上，每孔150 μL，3個重復(fù)接種在同一個微平板上。25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每隔24小時用Biolog自動讀板儀在590 nm下讀數(shù)。計算平均吸光度值（AWCD）和多樣性指數(shù)，選取96 h的平均光密度值進(jìn)行主成分分析（唐希望等，2018；張建聰?shù)龋?019）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用Excel 2003和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，單因素方差分析檢驗各處理之間的差異顯著性，通過主成分分析法分析土壤微生物群落代謝功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物對土壤理化性狀的影響

根系分泌物不同收集時間根系分泌物回接培養(yǎng)后的土壤養(yǎng)分變化情況見表1。由表可知，根系分泌物回接到土壤中培養(yǎng)3周后，土壤pH值、有機碳、含水量、全氮、堿解氮、速效磷均有較明顯變化，而土壤全磷無明顯差異（P＞0.05）。土壤pH值變化范圍在6.01—7.32之間，其中不同濃度根系分泌物處理pH值顯著低于CK（P＜0.05）；不同濃度根系分泌物處理下有機碳、含水量、全氮、堿解氮、速效磷含量顯著高于 CK（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為 HC＞MC＞LC＞CK。

表1 根系分泌物對土壤理化性狀的影響Table 1 Effect of root exudates on soil physical and chemical properties

2.2 植物根系分泌物對土壤微生物數(shù)量的影響

由圖1可知，不同濃度植物根系分泌物對土壤微生物數(shù)量有顯著影響，不同濃度植物根系分泌物處理下細(xì)菌、真菌、放線菌和微生物總數(shù)均顯著高于對照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為 HC＞MC＞LC＞CK。

圖1 植物根系分泌物對土壤微生物數(shù)量的影響Fig. 1 Effect of root exudates on soil microbial population

2.3 植物根系分泌物對土壤微生物學(xué)特征的影響

由圖2可知，不同濃度植物根系分泌物對土壤微生物學(xué)特征有顯著影響，不同濃度植物根系分泌物處理下微生物量碳、微生物熵和基礎(chǔ)呼吸均顯著高于對照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK。土壤代謝熵表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK，HC和MC差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 植物根系分泌物對土壤微生物學(xué)特征的影響Fig. 2 Effect of root exudates on soil microbial characteristics

2.4 土壤微生物群落代謝平均吸光值變化

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，各處理微生物碳源利用總體上呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。在 24—72 h內(nèi)土壤微生物群落AWCD值快速增長，此時微生物活性旺盛，之后則趨于平穩(wěn)進(jìn)入平臺期，培養(yǎng)至156 h時AWCD又出現(xiàn)小幅度上升。高濃度根系分泌物處理土壤的 AWCD值在整個培養(yǎng)期內(nèi)均高于對照及其他處理，且在 72 h后幅度明顯上升。AWCD值大小順序為：高濃度＞中濃度＞對照＞低濃度。

圖3 土壤微生物群落代謝平均吸光值變化Fig. 3 Changes of mean metabolic absorbance value of soil microbial community

2.5 植物根系分泌物對土壤微生物群落代謝的影響

圖4為96 h的平均吸光值計算土壤微生物群落多樣性指數(shù)。由圖可知，不同濃度植物根系分泌物對土壤微生物群落多樣性有顯著影響，不同濃度植物根系分泌物處理下平均吸光值、物種豐富度指數(shù)、Mcintosh指數(shù)均顯著高于對照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK。不同處理間優(yōu)勢度指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 植物根系分泌物對土壤微生物群落代謝的影響Fig. 4 Effect of root exudates on soil microbial community metabolism

2.6 土壤微生物群落代謝功能主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）采取降維的方法，使用少數(shù)相互無關(guān)的綜合指數(shù)反映原始數(shù)據(jù)中所包含的絕大多數(shù)信息。對不同處理培養(yǎng)96 h后土壤微生物碳源利用能力進(jìn)行主成分分析，取第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）做圖表征微生物群落的代謝特征（圖5）。由圖可知，主成分分析中提取的兩個主成分因子分別可以解釋所有變量方差的43%和32%。CK和中濃度主要分布在PC2軸的正值端，高濃度主要分布在PC2軸的負(fù)值端，而低濃度則在正負(fù)方向均有分布。4個處理在PC1軸的正負(fù)兩端均有分布，并未實現(xiàn)很好的分離。由此可見，中濃度根系分泌物處理的土壤與 CK土壤微生物群落代謝特征相近，其明顯不同于高濃度根系分泌物處理的土壤，說明它們對單一碳源的利用能力不同，其群落代謝特征存在差異。

圖5 土壤微生物群落代謝功能主成分分析Fig. 5 Metabolic function principal component analysis of soil microbial community

不同濃度植物根系分泌物處理下平均吸光值、物種豐富度指數(shù)、Mcintosh指數(shù)均顯著高于對照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為 HC＞MC＞LC＞CK。不同處理間優(yōu)勢度指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。主成分分析表明：中濃度根系分泌物處理的土壤與CK土壤微生物群落代謝特征相近，其明顯不同于高濃度根系分泌物處理的土壤，說明它們對單一碳源的利用能力不同，其群落代謝特征存在差異。

3 討論

根系分泌物在改善土壤屬性、提高污染物生物可利用性、緩解環(huán)境脅迫等方面具有重要作用。一方面，根系分泌的某些胞外酶能夠直接參與污染物的降解過程（高雪峰等，2016；易艷靈等，2019；張小全等，2019）；另一方面，分泌物中的可溶性糖、低分子量有機酸、氨基酸等物質(zhì)，為根際微生物提供充足的營養(yǎng)，增加根際微生物的數(shù)量、提高微生物活性，進(jìn)而加速養(yǎng)分的分解。植物根系土壤理化性狀變化是植物對土壤樣分的充分吸收、利用，及其適應(yīng)環(huán)境能力的最直接體現(xiàn)（劉海等，2019）。研究結(jié)果表明，不同濃度根系分泌物處理pH值顯著低于CK（P＜0.05）；不同濃度根系分泌物處理下有機碳、含水量、全氮、堿解氮、速效磷含量顯著高于 CK（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK ；而土壤全磷無明顯差異（P＞0.05），與前人的研究結(jié)果一致（徐煒杰等，2017；王璐等，2019）。主要是由于根系分泌物中酸類物質(zhì)水解增加土壤H＋濃度，使土壤pH降低。

土壤微生物量碳與代謝熵等雖是反映土壤質(zhì)量的重要微生物學(xué)指標(biāo)，但卻不能反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成，在評價土壤質(zhì)量方面有一定的局限性。土壤微生物種群組成決定了土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)及退化土壤質(zhì)量的恢復(fù)進(jìn)程，因此，對進(jìn)入土壤的根系分泌物引起的土壤微生物群落組成與功能變化的評價十分重要（Chang，2019）。Biolog方法是基于微生物群落對碳源的利用度來描述微生物功能的動態(tài)變化，該方法具有靈敏度高，無需分離純培養(yǎng)微生物，簡便、快速等特點，被研究人員廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落多樣性的研究（Du et al.，2020）。本試驗中共檢測了 3種微生物的數(shù)量變化，結(jié)果顯示，不同濃度植物根系分泌物處理下細(xì)菌、真菌、放線菌和微生物總數(shù)均顯著高于對照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK，與前人的研究結(jié)果吻合。他們的結(jié)果證實了植物根系分泌物中的葡萄糖、有機酸和酚酸等小分子化合物可以增加細(xì)菌和真菌的豐富度，同時可以促進(jìn)土壤中細(xì)菌及真菌數(shù)量的生長。植物對土壤環(huán)境的重要影響之一是改變土壤微生物群落特征。研究證實不同的作物對土壤微生物群落的影響不同，作物通過根系分泌物在塑造土壤微生物群落中起著重要的作用，不同作物根系分泌物的成分和含量不同，其為根際微生物提供大量的營養(yǎng)和能量物質(zhì)，使土壤微生物的活性和生態(tài)分布發(fā)生改變，并改變了土壤微生物群落的生長代謝，從而產(chǎn)生明顯的根際效應(yīng)（Wang et al.，2018）。

4 結(jié)論與展望

研究了不同濃度植物根系分泌物的微生態(tài)效應(yīng)（土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落功能多樣性、微生物量碳、微生物熵、基礎(chǔ)呼吸和代謝熵）。不同濃度根系分泌物處理 pH值顯著低于 CK（P＜0.05）；有機碳、含水量、全氮、堿解氮、速效磷含量顯著高于 CK（P＜0.05）。細(xì)菌、真菌、放線菌、微生物總數(shù)、微生物量碳、微生物熵和基礎(chǔ)呼吸均顯著高于對照（P＜0.05）。綜合分析表明：中濃度根系分泌物處理的土壤與CK土壤微生物群落代謝特征相近，其明顯不同于高濃度根系分泌物處理的土壤，說明它們對單一碳源的利用能力不同，其群落代謝特征存在差異。然而，在實際的根系環(huán)境中，根系分泌物成分復(fù)雜，根系微環(huán)境組成和影響因素多種多樣。本試驗在相同的土壤條件下，僅澆灌不同提取時間的根系分泌物而使得植物根際土壤微生物數(shù)量和土壤理化性狀產(chǎn)生差異，這說明根際土壤微環(huán)境與植物根系分泌物產(chǎn)生和釋放的種類和濃度有密切關(guān)系。雖然根系分泌物中小分子化合物、有機酸、酚酸等物質(zhì)的功能已有大量研究，但大多數(shù)物質(zhì)在復(fù)雜多樣的根際環(huán)境中的作用是否與其單獨作用對土壤微生物和理化性狀的影響是否具一致性，仍需進(jìn)一步研究。